梅毒的病程长，症状复杂，可与很多其他疾病的表现相象，需要结合病史、体检和实验室检查的结果，进行综合分析，才能得出诊断。病史包括感染史，有无非婚性行为和婚外性行为；性病经过，有无硬下疳和二、三期梅毒的经过；婚姻史；分娩史和治疗经过等。进行全面细致的体格检查，包括掌跖部位、外生殖器、口腔等部位，病程长的患者主要检查神经系统、骨、心脏等。
梅毒的实验室检查很重要，对疾病的诊断有重要的价值，包括梅毒螺旋体的检查、梅毒血清试验等，包括非螺旋体抗原试验（USR、VDRL、RPR、TRUST）和螺旋体抗原血清试验（TPPA、FTA-ABS、EIA等）。