1.小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉后,用立体定位仪固定头部。
2.头顶部皮肤常规消毒,正中矢状切开头皮,依照小鼠图谱坐标定位,颅骨钻孔,在纹状体部位用微盘进样器徐缓注人0.5µL10%BDA溶液(溶于生理盐水),5min内注射完毕,留针lOmin后缓慢退出。
3.动物存活7d后进行灌注固定,取出脑组织。
4.25%蔗糖脱水后,进行连续冠状冰冻切片,片厚14µm,切片贴于包被明胶的载玻片上。
5将含黑质部位的切片分别入0.1MPBS中漂洗后,入含有辣根过氧化物酶-链霉卵白素复合物(0.1M PBS 1:500稀释)中,孵育2h后进行DAB显色。
6.脱水、透明,DPX封片。第5步也可以进行加入抗生物素的荧光二抗进行孵育,然后封片,用荧光显微镜观察。BDA可用于顺行和逆行追踪,但顺行追踪的效果更好一些,可以很清楚地观察到在中脑黑质部位棕色的DAB显色阳性纤维和绿色荧光阳性纤维,可见,由BDA追踪的神经纤维末梢形态比较清楚,可以观察到由纹状体向黑质的投射情况。 展开 |