酶消化法
胰蛋白酶消化法
实验方法原理 |
胶质细胞具有复杂多样的结构和表达丰富的分泌产物,它含有大部分神经递质、神经肽、激素及神经营养因子受体、离子通道、神经活性氨基酸亲和载体、细胞识别分子,并能分泌多种神经活性物质(生长因子、神经营养因子和细胞因子等)。 神经细胞(神经元)不易培养,只有在适宜情况下,如接种在胶原底层上,或加入神经生长因子和胶质细胞因子时,可出现一定程度的分化,长出突起等现象,但很难使之增值。而神经胶质细胞是神经组织中比较容易培养的成分。 |
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实验材料 | 大鼠 |
试剂、试剂盒 | MEM FBS 胰酶 EDTA D-Hanks’液 |
仪器、耗材 | 眼科剪 滴管 离心机 培养皿 CO2培养箱 |
实验步骤 |
1. SD 大鼠经低温麻醉后以碘酒和75%乙醇消毒,无菌操作下,断头放入预冷的D-Hanks’液中,在解剖显微镜下取大脑皮层并除去脑膜。
2. 剪碎组织成1 mm3 大小,加入胰酶-EDTA消化液并放入 37℃孵箱内消化20 min,中间摇晃一次。
3. 随后用滴管吸出组织转移到装有预冷的 MEM+10%FBS(Glial Medium,GM)的离心管内终止消化液作用5 min。
4. 吸出组织转移到另一支装有冷的 GM 的离心管内,用火焰抛光的巴斯德滴管吹打数次,静置后取上清并吸到另一支离心管内。重复上述步骤 2~3 次。
5. 所得上清于800 rpm 离心5 min,弃上清,管内加入新鲜培养液并吹打成单细胞悬液。细胞计数,调整细胞密度1.5×105/cm2 种入 25 cm2 培养瓶,放入孵箱培养。以后每隔2~3 d 进行全量换液。
6. 摇床振摇分离星形胶质细胞和少突胶质细胞:培养至7~10 天,换液后放入孵箱继续培养24 h,取出拧紧培养瓶盖,于37℃恒温摇床上280 rpm 摇 动18 h。此时寡突胶质细胞 90%以上在培养悬液内而与瓶底贴壁的星形胶质细胞分离。
7. 分离培养悬液内的少突胶质细胞:吸出悬液至离心管内950 rpm 离心10 min,弃上清后管内加入新鲜GM,吹打成单细胞悬液,按1.5×105/cm2 种入预先用100 µg/L 多聚赖氨酸包被好的 35 mm 培养皿培养。24 h 后换成DF12+N2 的无血清 培养液,此后每三天半量换液1 次。
8. 瓶底星形胶质细胞的继续培养:25 cm2 培养瓶内的星形胶质细胞用D-Hanks’液洗2 次后常规传代,以 1.5×105/cm2 种入预先用100 µg/L 多聚赖氨酸包被好的35 mm 培养皿培养。培养液为GM,每三天半量换液1 次。附GFAP鉴定星形胶质细胞图片。
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注意事项 |
做原代混胶细胞,相对来说比较好养。
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