细胞凋亡检测方法介绍

细胞凋亡是指细胞在生长到一定阶段及某些生理过程中，会受到多因素和机制的严格调控而进入死亡。这是一个动态的过程,会涉及一系列复杂的生化反应, 是一个需要酶参与的级联反应,同时也涉及不同基因的表达及调控、信号传导。其中有几项生理过程能被用来检测凋亡的发生，因此多参数分析法对于准确检测这一过程十分重要。同时，了解细胞死亡和存活机制也是毒理分析和药物研发应用中一个非常关键的内容。 Sigma®联合Roche®提供多种分析细胞凋亡的研究方法。包括：Caspase活性检测；DNA片段化分析和检测；膜变化检测（AnnexinV染色、膜电位、线粒体功能完整性分析检测实验）及细胞形态学检测。

Caspase活性检测

Caspase (cysteinyl-aspartic acid proteases)是一个家族的蛋白酶，它的活化是细胞凋亡的典型特征。一旦一个Caspase 酶被激发，就会激活一系列其他的Caspas酶,裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。Caspase 3 活化发生在凋亡早期，并在凋亡过程中起重要作用。Caspase 3 Activity Assay (CASP3C) 基于荧光免疫酶测定，能在体外特异性地对Caspase 3进行定量。

膜变化检测

凋亡细胞另一个生化特征是细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸从胞质转至胞外。膜联蛋白中的Annexin V，是一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有强亲和力。通过使用Annexin V FLUOS Staining Kit (11988549001) 或Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (APOAF) 方法进行凋亡细胞早期检测。可使用流式细胞仪或荧光显微镜监测。同时使用PI，根据细胞膜的通透性区分早期凋亡细胞和坏死细胞。 线粒体膜电位和膜通透性的变化也是凋亡细胞一个重要特点。可使用Cytochrome c Oxidase Assay Kit (CYTOCOX1) 试剂盒检测凋亡细胞线粒体所释放的细胞色素C。也可使用Mitochondria Isolation Kit 1 (MITOISO1) 分离凋亡细胞线粒体，其膜电位可通过Mitochondrion Membrane Potential Kit (MAK146-1KT) 检测。

DNA片段化分析

DNA降解也是细胞凋亡的典型标志之一,其降解产物可分为两种，即高分子量的单链DNA缺口以及低分子量DNA片断(单链及寡聚核小体)。单链DNA缺口有特定的检测方法，即利用酶催化，将特定核酸标记到游离的3'-OH末端，这种方法被称为 TUNEL。Roche提供的基于TUNEL法的In Situ Cell Death Kit, fluorescein （11684795910）能够在组织及单细胞中检测到低水平的凋亡，灵敏度高，背景干扰小，且可通过后续的流式、荧光显微镜、光学显微镜检测对细胞凋亡进行定量。 在凋亡细胞的细胞质中出现的组蛋白联合的DNA片断(单链及寡聚小体)，可使用Cell Death Detection ELISAPLUS（11774425001）高通量地检测细胞死亡，或使用Apoptotic DNA-Ladder Kit （11835246001）通过纯化及琼脂糖电泳分析这些呈现出典型的ladder状态的DNA片断。

细胞形态学检测

细胞形态的变化如胞膜皱摺或出泡、核染色质致密、胞质浓缩等，都可作为细胞凋亡的证据。一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA特异性染料有：Hoechst 33342 (B2261)，Hoechst 33258 (B2883), DAPI (D9542)。三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。