细胞增殖检测

血细胞 淋巴细胞

RPMI-1640 细胞培养液 2-巯基乙醇 青霉素 链霉素 刀豆蛋白A Hank's液 PBS缓冲液 3H-TdR

筛网 96孔培养板 手术器械 二氧化碳培养箱 超净工作台 液体闪烁仪 多头细胞取集器 49型玻璃纤维滤纸

1. 外周血单个核细胞的采集

（1） 用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞 80 - 100ml；

（2） 淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞（PBMC）。

（3） 无血清培养液洗涤 2 次，获得纯度在 90%以上的 PBMC，细胞数量需达到 1-3 x10⁸

2. 肿瘤抗原的制备

（1） 手术切除肿瘤标本，无菌条件下，将坏死组织和癌旁非肿瘤组织去除干净；

（2） 无菌生理盐水洗 3 次；

（3） 用无菌的组织剪将肿瘤组织剪碎，加入 RPMI 1640 培养基，充分研磨；

（4） 200 目无菌网过滤后收集单细胞悬液；

（5）用 RPMI 1640 培养基重悬细胞至 1-2 x10⁷/ml，装入 5ml 无菌冻存管中；

（6）将冻存管浸入液氮中速冻，10 min 后取出，再迅速放入 37℃ 水浴中解冻 10 min。反复 3-5 次；（注：也可以-80℃/37℃ 反复冻融 3-5 次。）

（7） 将肿瘤裂解物加入离心管中，3000rpm，离心 10min；

（8） 收集上清，0.22μm 滤膜过滤除菌，留样检测蛋白含量及细菌、真菌和支原体；

（9） -80℃保存备用。

3. DC细胞的培养

（1）步骤 1 中获得的 PBMC 用无血清培养液调整细胞浓度至 2 x10⁶/ml，置于培养瓶内；

（2）37℃，5% CO2 培养箱中孵育 2h，以使单核细胞贴壁；

（3）洗去悬浮细胞，在贴壁细胞中加入含重组人 GM-CSF（500-1,000U/ml）和重组人 IL-4（500U/ml）的无血清培养液，37℃，5%CO₂培养箱中培养，诱导单核细胞向 DC 细胞分化；

（4） 每 2-3d 半量换液一次，并补足细胞因子；

（5）（可选步骤） 在培养的第 5d， 加入步骤 2 中获得的肿瘤抗原 50 μg/ml，对 DC 进行抗原负载；（注：若不对 DC 进行抗原负载，该步省略。）

（6）在培养的第 6d，加入重组人 TNF-α（10ng/ml），IL-1β（10ng/ml），IL-6（1000U/ml）和PGE2（1μg/ml），诱导 DC 细胞成熟；

（7） 在培养的第 7d 或第 8d，收获 DC 细胞，其数量应达到 1×10⁶个以上；

（8）DC 的质检：

① 活细胞比例：台盼蓝染色验证活细胞应在 90%以上；

② 形态学观察：>90%细胞半悬浮，细胞有多个树突样突起；

1. DC来源广泛，对实验的结果影响很大，来源包括，外周血单核细胞（Monocyte）、脐带血 CD34+细胞、骨髓和胎肝等，但因外周血单核细胞最容易获取、数量也最多，所以临床上被广泛用作 DC 的来源细胞。

2. DC 的成熟度两种，即 iDC 和 mDC，而 DC 的抗原递呈能力与其成熟状态密切相关。iDC 的抗原摄取和加工能力较强，但抗原递呈能力很弱。在体外培养时，iDC 去除细胞因子（即 GM-CSF 和 IL-4）后，会逆转为巨噬细胞，且即使在细胞因子的维持下，未成熟 DC 的功能也不是激活 T 细胞，而是抑制 T 细胞的增殖。mDC 则正好相反，其抗原摄取和加工能力很弱，但具有很强的抗原递呈能力。因而可以激活 T 细胞，引起免疫反应。而且 DC 成熟后即使在培养体系中去除细胞因子，仍能保持 DC 的状态和功能，不会发生逆转。因此可以看出，DC 必须完全成熟后才能用于免疫治疗。

3.树突细胞的观察：树突细胞的观察需要借助透射电镜，透射电镜可见DCs伸展的突起，扫描电镜还可以拍摄到DC正在捕捉凋亡小体。

1. 从 DC 的祖细胞（如单核细胞）诱导分化为未成熟 DC：IL-4 在由单核细胞诱导成 DC 的过程中发挥的作用是抑制巨噬细胞的过度生长，从而引导单核细胞向 DC 方向分化。 若培养体系中不加 IL-4，单核细胞将分化为巨噬细胞。同时，IL-4 还有降低细胞表面表达 CD14 分子的能力。CD14 表达水平的降低是单核细胞分化为 DC 的重要标志。

2. 从 iDC 诱导分化为成熟 DC ：TNF- ，IL-1 和 IL-6 均为促炎症因子，在感染局部和肿瘤部位被诱导产生。体外研究表明，这 3 种细胞因子均可下调未成熟 DC 的巨胞饮作用和表面 Fc 受体的表达，使细胞内 MHC II 类分子区室（class II compartment）消失，但能够上调细胞表面 MHC I类、II 类分子和 B7 家族分子（CD80, CD86 等）的表达， 使未成熟 DC 分化为成熟 DC，此时 DC 的抗原摄取和加工能力明显减弱，而抗原递呈能力显著增强，可极强地激活 T细胞。TNF- IL-1 IL-6 三因子组合可在无牛血清培养条件下诱导 DC 的完全成熟，从而制备出可以应用于临床的 DC。

3. 树突细胞的提呈抗原的方法主要有①抗原多肽刺激的DCs②酸提抗原刺激的DCs③肿瘤抗原编码基因导入DCs④肿瘤mRNA刺激的DCs⑤细胞因子基因修饰DCs及其与肿瘤细胞融合。