细胞膜完整性及膜转运功能检测实验

1. 主要试剂的的配制

碘化丙锭（PI）染色液（4℃ 避光保存）：Pl，100 μg/ml；TritonX-100，1.0%；NaCl 0.9%。

2. 操作流程

2.1 样本的准备

2.1.1 培养细胞收集悬浮细胞于 Eppendorf 管中。贴壁细胞用胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，1000r/min离心 5 min。

2.1.2 新鲜实体组织取材组织用 PBS 漂洗干净后，浸泡在含 PBS 的平皿或青霉素小瓶内，用眼科剪尽可能将组织剪碎，吸去上清液，组织块转入大瓶中加入 10～20 ml 酶（200 μg/ml胶原酶），37℃ 消化 30 min，在不锈钢网上轻轻研磨，使组织和细胞分离，用 200 目筛网过滤 2 次。

2.1.3 石蜡切片组织切 50 μm 厚切片 4 张，置玻璃试管中，加二甲苯 5 ml，脱蜡 3×5 min，无水乙醇洗3×5 min，蒸馏水洗 5 min，加 2 ml 0.5% 胃蛋白酶（pH 1.0），振荡消化 30 min，PBS 洗终止消化，最后用 200 目筛网过滤2次。

2.2 染色方法

制备好的单细胞悬液可用70% 乙醇固定，4℃ 保存备用。染色前用PBS稀释单细胞，离心沉淀，弃上清，加入 200 μl RNA 酶 A，37℃ 水浴30 min，再加入 800 μl PI 染色液，混匀，4℃ 避光孵育 30 min。

2.3 上机检测记录

激发波长 488 nm 处红色荧光。

3. 结果观察

细胞凋亡时，G1 峰左侧出现亚二倍体细胞群的峰型。在光散射图谱上，前向光散射低于正常，侧向光散射高于正常。细胞坏死时，细胞周期中的细胞均出现不同程度的减少，亚二倍体细胞量多少不等。在光散射图谱上，的向光散射和侧向光散射均高于正常。