关于培养细胞样品:
1.融解ripa裂解液,混匀。取恰当量的裂解液,在运用前数分钟内参加pmsf,使pmsf的终浓度为1mm。
2.关于贴壁细胞:去除培养液,用pbs、生理盐水或无血清培养液洗一遍(假如血清中的蛋白没有干扰,能够不洗)。按照6孔板每孔参加150-250微升裂解液的份额参加裂解液。用枪吹打数下,使裂解液和细胞充沛接触。一般裂解液接触细胞1-2秒后,细胞就会被裂解。
关于悬浮细胞:离心收集细胞,用手指把细胞用力弹散。按照6孔板每孔细胞参加150-250微升裂解液的份额参加裂解液。再用手指轻弹以充沛裂解细胞。充沛裂解后应没有明显的细胞沉积。假如细胞量较多,必需分装成50-100万细胞/管,然后再裂解。
3.充沛裂解后,10000-14000g离心3-5分钟,取上清,即可进行后续的page、western和免疫沉积等操作。
裂解液用量说明:一般6孔板每孔细胞参加150微升裂解液现已足够,但假如细胞密度十分高能够恰当加大裂解液的用量到200微升或250微升。
关于安排样品:
1.把安排剪切成细微的碎片。
2.融解ripa裂解液,混匀。取恰当量的裂解液,在运用前数分钟内参加pmsf,使pmsf的终浓度为1mm。
3.按照每20毫克安排参加150-250微升裂解液的份额参加裂解液。(假如裂解不充沛能够恰当增加更多的裂解液,假如需求高浓度的蛋白样品,能够恰当减少裂解液的用量。)
4.用玻璃匀浆器匀浆,直至充沛裂解。
5.充沛裂解后,10000-14000g离心3-5分钟,取上清,即可进行后续的page、western和免疫沉积等操作。
6.假如安排样品本身十分细微,能够恰当剪切后直接参加裂解液裂解,通过激烈vortex使样品裂解充沛。然后同样离心取上清,用于后续试验。直接裂解的优点是比较方便,不用运用匀浆器,缺陷是不如运用匀浆器那样裂解得比较充沛。
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