细菌胞外蛋白含量测定实验

(一)实验原理
这种蛋白质测定法是最ling敏的方法之一.过去此法是应用最广泛的一种方法,由于其试剂乙的配制较为困难(现在已可以订购),近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代.此法的显色原理与双缩脲方法是相同的,只是加入了第二种试剂,即Folin—酚试剂,以增加显色量,从而提高了检测蛋白质的灵敏度.这两种显色反应产生深兰色的原因是:在碱性条件下,蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物.Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原,产生深兰色(钼兰和钨兰的混合物).在一定的条件下,兰色深度与蛋白的量成正比.

Folin—酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤.以后在生物化学领域得到广泛的应用.这个测定法的优点是灵敏度高,比双缩脲法灵敏得多,缺点是费时间较长,要精确控制操作时间,标准曲线也不是严格的直线形式,且专一性较差,干扰物质较多.对双缩脲反应发生干扰的离子,同样容易干扰Lowry反应.而且对后者的影响还要大得多.酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用.浓度较低的尿素(0.5%),硫酸纳(1%),硝酸纳(1%),三氯yi酸(0.5%),乙醇(5%),乙mi(5%),丙酮(0.5%)等溶液对显色无影响,但这些物质浓度高时,必须作校正曲线.含硫酸铵的溶液,只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液,即可显色测定.若样品酸度较高,显色后会色浅,则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1~2倍.

进行测定时,加F olin—酚试剂时要特别小心,因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定,但上述还原反应只在pH=10的情况下发生,故当Folin一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中时,必须立即混匀,以便在磷钼酸—磷钨酸试剂 被破坏之前,还原反应即能发生.
此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定.
此法可检测的最di蛋白质量达5mg.通常测定范围是20~250mg.

(二)试剂与器材
1.试剂
(1)试剂甲：
(A) 10克 Na2CO3,2克 NaOH和0.25克酒石酸钾钠 (KNaC4H4O6·4H2O).溶解于500毫升蒸馏水中.
(B) 0.5克硫酸铜(CuSO4·5H2O)溶解于100毫升蒸馏水中,每次使用前,将50份(A)与1份(B)混合,即为试剂甲.

(2)试剂乙：
在2升磨口回流瓶中,加入100克钨酸钠(Na2WO4·2H2O),25克钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)及700毫升蒸馏水,再加50毫升 85%磷酸,100毫升浓盐酸,充分混合,接上回流管,以小火回流10小时,回流结束时,加入150克 硫 酸锂(Li2SO4),50毫升蒸馏水及数滴液体溴,开口继续沸腾15分钟,以便驱除过量的溴.冷却后溶液呈黄色(如仍呈绿色,须再重复滴加液体溴的步骤).稀释至1升,过滤,滤液置于棕色试剂瓶中保存.使用时用标准NaOH滴定,酚酞作指示剂,然后适当稀释,约加水1倍,使最终的酸浓度为1N左右.

(3)标准蛋白质溶液:
精确称取结晶牛血清清蛋白或 g—球蛋白,溶于蒸馏水,浓度为250 mg/ml左右.牛血清清蛋白溶于水若混浊,可改用0.9 % NaCl溶液.

2. 器材
(1)可见光分光光度计
(2)旋涡混合器
(3)秒表
(4)试管16支

(三)操作方法
1. 标准曲线的测定：取16支大试管,1支作空白,3支留作未知样品,其余试管分成两组,分别加入0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0毫升标准蛋白质溶液(浓度为250mg/ml).用水补足到1.0毫升,然后每支试管加入5毫升试剂甲,在旋涡混合器上迅速混合,于室温(20～25℃)放置 10分钟.再逐管加入0.5毫升试剂乙(Folin—酚试剂),同样立即混匀.这一步混合速度要快,否则会使显色程度减弱.然后在室温下放置30分钟,以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照,于700nm处测定各管中溶液的吸光度值.以蛋白质的量为横座标,吸光度值为纵座标,绘制出标准曲线.

注意：因Lowry反应的显色随时间不断加深,因此各项操作必须精确控制时间,即第1支试管加入5毫升试剂甲后,开始计时,1分钟后,第2支试管加入5毫升试剂甲,2分钟后加第3支试管,余此类推.全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟,则第1支试管可立即加入0.5毫升试剂乙,1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙,2分钟后加第3支试管,余此类推.待最后一支试管加完试剂后,再放置30分钟,然后开始测定光吸收.每分钟测一个样品.
进行多试管操作时,为了防止出错,每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面的表格.表中是每个试管要加入的量(毫升),并按由左至右,由上至下的顺序,逐管加入.最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量(微克)和测得的吸光度值.

Folin—酚试剂法实验表格：
管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
标准蛋白质 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0(250mg/ml)
未知蛋白质 0.2 0.4 0.6(约250mg/ml)
蒸馏水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.6 0.4
试剂甲 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
试剂乙 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
每管中蛋白质的量(ug)
吸光度值(A700)

2. 样品的测定：取1毫升样品溶液(其中约含蛋白质20~250微克),按上述方法进行操作,取1毫升蒸馏水代替样品作为空白对照.通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起,同时进行.即在标准曲线测定的各试管后面,再增加3个试管.如上表中的8、9、10试管.
根据所测样品的吸光度值,在标准曲线上查出相应的蛋白质量,从而计算出样品溶液的蛋白质浓度.
注意,由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸,显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化.因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度(相对于标准蛋白质).