结核杆菌PCR鉴定

   从痰等临床标本直接诊断结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌也称直接扩增试验（Direct Amplification Test，DAT），主要是利用PCR技术特异性地扩增核酸片断达到鉴定结核分枝杆菌的目的。RocheLight Cycler 荧光定量PCR仪，从标本处理、核酸扩增到产物鉴定都有配套的试剂和设备，基本是自动化过程，检测质量容易控制。扩增靶基因可以是DNA，也可以是RNA，商用试剂一般多用结核分枝杆菌的特异性片断，如16SRNA、插入序列IS6110、编码38KD磷酸结合蛋白的PAB基因等。

　　核酸扩增技术可在数小时内完成，可以鉴别结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌，同时具有很高的敏感性，可以少到检出标本中的10个结核分枝杆菌，与涂片抗酸染色相比，具有很大的优势。在痰涂片抗酸染色阳性的标本，DAT的敏感性为95%，特异性为98%；在涂片阴性而培养阳性的痰标本，其敏感性为48～53%，特异性为95%。FDA开始只批准DAT用于AFB阳性的标本，用来确定AFB的结果和鉴别非结核分枝杆菌。

　　目前已批准用于所有临床怀疑结核病的痰标本检测，其敏感性在75～88%，特异性高达100%。原理 LightCycler是Roche公司新近开发的一种PCR定量技术，该技术的特点也是将荧光分子和淬灭分子分别标记在两个不同的探针上，产生发光探针和淬灭探针，发光探针的5’端连接荧光分子；淬灭探针的3’端连接荧光分子。由于两探针设计时可与模板同一条链相邻的序列杂交，杂交时两探针的荧光分子和淬来分子便紧密相邻，从而发生FRET而使荧光淬灭。

　　荧光淬灭的程度与起始模板的量成反比，以此可以进行PCR定量分析.