发布时间:2020-07-27 11:34 原文链接: 膜片钳技术的应用进展(二)

2.3  实验的一般操作步骤

 

    ①拉制微电极和充灌微电极;②将预先处理的实验标本置于显微镜载物台上的灌流槽内;③于显微镜低倍镜下,用微操纵器将电极移动到浴液上方,换用高倍镜按一 定标准选择合适的细胞,然后接近靶细胞或组织,完成电极与标本的封接;④给予钳位电压或电流等指令条件并分别记录电流、电压等参数;⑤对电流等性质分析后,施加不同的药物记录并分析电流等参数。

 

    2.4  实验数据的记录与分析

 

    膜片钳实验记录的离子通道电流是一连串近似矩形的脉冲信号。在通道开放期间,信号的形态复杂多样,有时是多个矩形波单位幅值簇状发放(burst),有时 有短暂的间隔,时而有簇状串(cluster)等,表示离子穿越通道的过程并非全部线性连续而富含非线性过程。通道的开放时程是随机变化的指数形式分布。用指数和的分布,求取平均开放时间才能更精确地描述通道的活动,往往需要成百上千个通道电流数据,这样庞大的分析工作必须借助于计算机完成。

 

3  膜片钳实验的常用工作模式

 

    3.1  细胞吸附式膜片

    细胞吸附式膜片(cell attached patch) 是膜片钳的基本方式,其它方式由此衍生。这种膜片形式比较稳定,因细胞骨架及有关代谢过程是完整的,故对细胞结构和环境干扰最小。但这种膜片形式易在电极尖端形成囊泡,从而细胞骨架可能有所变化。另外这种膜片不能控制细胞内成分。且任何影响膜电位的处理均可影响其电位水平。

 

    3.2  内面向外式膜片

 

    内面向外式膜片(inside out patch)细胞内外和电极内的溶液均可调控,既能较容易地改变细胞内的离子或物质浓度,又能把酶等直接加于膜的内侧面,适宜研究胞内物质对通道活动的影响。但实验中难以改变膜外侧物质,且需浸于低钙液中。常用于研究依赖细胞内钙的离子通道,如钙敏感的钾通道,还可用于细胞内激素和第二信使与通道的调节作用。

 

    3.3  外面向外式膜片

 

    外面向外式膜片(outside out patch) 能接触膜的两侧,可以任意改变膜外物质的浓度,有利于研究离子、递质对膜外表面的作用,多用于研究细胞膜外侧受体控制的离子通道。这些受体直接作用于离子通道,而不需经过第二信使系统。因细胞外液容易更换,故加药方便。缺陷是实验中难以改变胞内成分,而且电极管内必须充以低钙液。

 

    3.4  全细胞式膜片

 

    全细胞式膜片(whole cell patch)方式使细胞内与浴槽之间的漏流极少。电极本身阻抗(1~ 10 MΩ)与细胞封接后的阻抗相比较低,这种低接触阻抗使单管电压钳容易实现。电极管内与细胞之间弥散交换与平衡快,因而容易控制细胞内液的成分。细胞钳记录的是许多通道的平均电流,有利于综合分析。如果有目的地将膜电位钳制在某一程度,可做到选择性抑制某些通道的活性而只记录某种通道电流的总和,并可在同一 细胞上观察几种不同通道的情况。通过改变内部介质,如改变电极液成分,或在电极液中加入所需药物,通过渗透很快改变胞浆成分并达到平衡,该手段在全细胞记录中广泛应用。它适合于小细胞的电压钳位,对于直径大于30 μm的细胞很难实现钳位。不足之处是由于电极与细胞间交换快,细胞内环境很容易破坏,因此记录所用的电极液应与胞浆主要成分相同,如高K+,低Na+ 和Ca 2+及一定的缓冲成分和能量代谢所需的物质。

 

    3.5  穿孔膜片

    穿孔膜片 (perforated patch)  是为克服常规全细胞模式的胞质渗漏问题,有学者将与离子亲和的制霉菌素或二性霉素B经微电极灌流到含有类甾醇的细胞膜上,形成只允许一价离子通过的孔,用此法在膜片上做很多导电性孔道,借此对全细胞膜电流进行记录。由于此模式的胞质渗漏极为缓慢,局部串联阻抗较常规全细胞模式高,所以钳制速度很慢,也称为 缓慢全细胞模式。