色谱分析技术

高压液相色谱

Martin 和 Synge在1941年就提出高效相色谱的设想，然而直到六十年代后期，由于各种技术的发展，高效液相色谱才付诸实现。这种色谱技术曾被称为高速液相色谱（HighSpeed Liquid Chromatography），高压液相色谱（High Parss-ure Lipuid Chromatography），目前使用最多的名称是高效液相色谱（High Pe-rformance Liauid Chromatography，HPLC）。高效液相色谱已经广泛地应用，成为一项不可缺少的技术。它的主要优点是⑴分辩率高于其它色谱法；⑵速度快，十几分钟到几十分钟可完成；⑶重复性高；⑷高效相色谱柱可反复使用；⑸自动化操作，分析精，确度高。根据分离过程中溶质分子与固定相相互作用的差别，高效液相色谱可分为四个基本类型，即液－固色谱、液－液色谱、离子交换色谱和体积排阻色谱。高效液相色谱在生物领域中广泛用于下列产物的分离和鉴定：⑴氨基酸及其衍生物；⑵有机酸；⑶甾体化合物；⑷生物硷；⑸抗菌素；⑹糖类；⑺卟啉；⑻核酸及其降解产物；⑼蛋白质、酶和多肽；⑽脂类等。

一、分类

高效液相色谱法可分为四个基本类型：即液－固色谱法，键合相色谱法，离子交换色谱法及体积排阻色谱法。

（一）液－固色谱法

液－固色谱法通常称吸附色谱法，吸附剂有活性碳，氧化铝和硅胶，在液－固色谱法中用的载体都是硅胶。硅胶对溶质，分子的吸附能力不是平均分布在整个硅脱表面的，在硅胶表面有一些区域与溶质分子强烈相互作用，这些区域为活性位置，硅胶与溶质分子间主要作用是偶极距力氢键及静电相互作用。极性越强，而化合物在硅胶柱上的滞留时间也长。在液－固色谱中，依靠流动相溶剂分子与溶质分子竞争固定相互活性位置， 从而使溶质从色谱柱上洗脱下来。与硅胶表面活性位置结合力强的溶剂洗脱溶质分子的能力强，因而称强溶剂，反之为弱溶剂。液─固色谱法的特点是适于分离色谱几何异构体，可用于脂溶性化合物质如磷脂，甾体化合物，脂溶性维生素，前列腺素等。

（二）键合相色谱法

键合相色谱法是由液－液色谱法即分配色谱发展起来的。键合相色谱法将固定相共价结合在载体颗粒上，克服了分配色谱中由于固定相在流动中有微量溶解，及流动相通过色谱柱时的机械冲击，固定相不断损失，色谱柱的性质逐渐改变等缺点。键合相色谱法可分为正常相色谱法和反相色谱法。

1. 正常相色谱法

在正常相色谱法中共价结合到载体上的基团都是极性基团，如一级氨基、氰基、二醇基、二甲氨基和二氨基等。流动相溶剂是与吸附色谱中的流动相很相似的非极性溶剂，如庚烷、已烷及异辛烷等。由于固定相是极性，因此流动溶剂的极性越强，洗脱能力也越强，即极性大的溶剂是强溶剂。固定相与流动相的这种关系正好与液－固色谱法相同，称这种色谱法为正常相色谱法。尽管如此，正常相色谱法的分离原理主要根据化合物在固定相及流动相中分配系数的不同进行分离，它不适于分离几何异构体。