苏云金杆菌的血清学鉴定

一、目的：

1、学习抗原  及抗体的制备方法

2、学习试管凝集反应的方法及效价的测定

3、学会分析不同抗原（o抗原、H抗原）的方法

二、实验原理

将生物细胞或它们的磨碎物。提取物等注射到热血动物体内，动物血液中可以产生与注射物起作用的物质——抗体。能诱发抗体产生的注射物称为抗原。含有抗体的血清称为免疫  血清或抗血清。抗原和抗体之间会发生各种血清学反应，如凝集反应，沉淀反应等，它既专化又敏感，可用于鉴定和研究细菌等生物的亲缘关系。

三、实验器材及药品

1 U形管，试管 2 半固体培养基、肉汤培养基 3 接种环 4 高压锅 5 摇床 6 显微镜 7 离心机  8 0.25%甲醛生理盐水等

四、实验内容

1、 制备H-抗原

（1）制备半固体培养基：成份：牛肉膏1%，蛋白胨1%，琼脂0.4%，把半固体培养基装入装有U形玻璃管的试管中，15磅灭菌30min。

（2）活化菌种：将菌种接在盛有半固体培养基的U形管一端，一天后发现菌株运动到另一端后迅速取出，转接于第二支U形管中，如此3-5次。

（3）摇床培养：从最后一次活化管中取运动性最强的菌株接入500nl成有肉汤培养基的摇瓶内，每瓶含100ml培养基，其成份为：牛肉膏1%，蛋白胨1%，水100ml。每瓶接上一接种环，稍弄散，避免集中，放入30度摇床振荡培养9-10小时。

（4）无菌检查及离心：取出培养液，涂片，用苯酚品红染色，显微镜油镜检查，若无其他杂菌时，装入离心管3000转/分离心15-20分钟。倒去生理盐水，收集沉淀悬浮于0.25%甲醛生理盐水中。每塑料管用10ml甲醛生理盐水洗下装入试管，置冰箱待用。

（5）制备抗体：实验室中制备抗血清都用家免，大量生产则用马等。

i. 动物的准备：免疫注射采用体重2-3公斤的健康雄免。把免子固定在特制的木盆内，只留头部在外，将双耳边缘附近的毛用刀片剃去，用75%酒精消毒，再用少量二甲苯试去耳翼使静脉充血，取血少量，测定注射前的正常血清能否与测定的细菌发生凝集反应。如不进行了凝集反应，则可用来作免疫注射。

ii. 免疫注射：抗原尝试采用麦氏比色管第7管，采用5号针头注射。注射方案如下：第1天0.5ml，第3天1ml，第5天1.5ml，第2天ml，第9天2.5ml。再过6天后进行试血，当效价达2000左右时，即可大量采血。若效价太低，可继续补充注射。

iii. 兔子放血：先把兔子固定在小动物解剖台上，剪去颈部毛和颈部皮肤，直至现出食管为止。仔细在食管两侧稍靠下部找也左右两根颈动脉，用线绑住附近头端，再用止血钳钳住，在细线与止血钳间用剪刀剪断，再在两钳音剪断，动脉血就喷出，可用三角瓶接收。若要采用心脏取血法，则用9号注射针头对准家免以及跳动最激烈之筋骨刺入，进行抽血。

iv. 抗血清处理：室温下使血液凝固，分出血清，并进行了离心后再加1/10000硫柳汞置冰箱保存。最好把血清盛放在安培瓶中封口，贴上标签，置冰箱保存。

3． 效价测定：用一种抗原与一种抗血清反应

（1）取14根小试管在试管架上成一排

（2）用移液管加入生理盐水，第一管0.9ml，其余0.5ml。

（3）用移液管吸0.1ml抗血清于第一管，使之成1ml，再用另一支移液管从第一管吸0.5ml至第二管，一直类推至第13管。再从第13管吸也0.5ml去掉，第14管作为对照。