荧光原位杂交实验步骤

荧光原位杂交实验步骤

1）探针变性

将探针在75oC恒温水浴中温育5min，立即置0oC，5～10min，使双链DNA探针变性。

2）标本变性

①将制备好的染色体玻片标本于50oC培养箱中烤片2～3h。（经Giemsa染色的标本需预先在固定液中退色后再烤片）。 
      ②取出玻片标本，将其浸在70～75oC的体积分数70％甲酰胺/2×SSC的变性液中变性2～3min。 
      ③立即按顺序将标本经体积分数70％、体积分数90％和体积分数100％冰乙醇系列脱水，每次5min，然后空气干燥。

3）杂交

将已变性或预退火的DNA探针10μL 滴于已变性并脱水的玻片标本上，盖上18×18盖玻片，用Parafilm封片，置于潮湿暗盒中37oC杂交（约15～17h）。由于杂交液较少，而且杂交温度较高，持续时间又长，因此为了保持标本的湿润状态，此过程在湿盒中进行。

4）洗脱

荧光原位杂交实验步骤，此步骤有助于除去非特异性结合的探针，从而降低本底。

（1） 杂交次日，将标本从37oC温箱中取出，用刀片轻轻将盖玻片揭掉。 
      （2） 将已杂交的玻片标本放置于已预热42～50oC的体积分数50％甲酰胺/2×SSC中洗涤3次，每次5min。 
      （3） 在已预热42～50oC的1×SSC中洗涤3次，每次5min。 
      （4） 在室温下，将玻片标本于2×SSC中轻洗一下。 
      （5） 取出玻片，自然干燥。 
      （6） 取200μL复染溶液（PI/antifade或DAPI/antifade染液）滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。荧光原位杂交实验步骤

5）杂交信号的放大（适用于使用生物素标记的探针）

（1） 在玻片的杂交部位加150μL封闭液I，用保鲜膜覆盖，37oC温育20min。 
      （2） 去掉保鲜膜，再加150μL avidin-FITC于标本上，用保鲜膜覆盖，37oC继续温育40min。 
      （3） 取出标本，将其放入已预热42～50oC的洗脱液中洗涤3次，每次5min。 
      （4） 在玻片标本的杂交部位加150μL封闭液II，覆盖保鲜膜，37oC温育20min。 
      （5） 去掉保鲜膜，加150μL antiavidin于标本上，覆盖新的保鲜膜，37oC温育40min。 
      （6） 取出标本，将其放入已预热42～50oC的新洗脱液中，洗涤3次，每次5min。 
      （7） 重复步骤(1)、（2）、（3），再于2×SSC中室温清洗一下。 
      （8） 取出玻片，自然干燥。 
      （9） 取200μL PI/antifade染液滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。

6）封片

可采用不同类型的封片液。如果封片液中不含有Mowiol（可使封片液产生自封闭作用），为防止盖片与载片之间的溶液挥发，可使用指甲油将盖片周围封闭。封好的玻片标本可以在—20～—70oC的冰箱中的暗盒中保持数月之久。

7）荧光显微镜观察FISH结果

先在可见光源下找到具有细胞分裂相的视野，然后打开荧光激发光源，FITC的激发波长为490nm。细胞被PI染成红色，而经FITC标记的探针所在的位置发出绿色荧光。