荧光定量PCR应用——肿瘤篇

   肿瘤是是机体在各种致癌因素作用下，局部组织细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，从而导致其克隆性异常增生而形成的异常病变。学界将其分为良性和恶性两大类。肿瘤作为全球疾病致死的重要元凶之一，如果发现和治疗不及时，有可能导致人体消瘦、无力、贫血、食欲不振、发热及脏器功能受损等，其后果极为严重。

    实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）技术是在PCR技术的基础上发展起来的核酸定量技术，是1996年美国Applied Biosystems公司推出，它是通过在PCR反应体系中加入荧光基团，然后利用荧光信号的积累强弱实时监测整个PCR进程，zui后通过标准曲线对未知的DNA模板进行定量，实现了PCR从定性到定量的飞跃，为全面快速准确地分析样本中的各类待检物质提供了崭新的技术工具，现在已被广泛应用于实验室及临床肿瘤标志物的检测。

    Real-Time PCR与传统的PCR技术相比其使用了荧光探针标记特定核酸从而提高了准确性；灵敏度提高故使用较少的样本量，从而减少了样本消耗殆尽的风险，在一小时左右即可出结果，简化了传统PCR方法；全封闭管分析、利用电脑分析软件对PCR扩增产物的实时动态的检测和自动定量，定量动态范围高达五个数量级，且结果重现性较好，这也提高了检测的灵敏度和精密度。

Real-Time PCR在肿瘤检测与治疗方面的应用：

• 早期诊断、分型

    卵巢癌是妇科死亡率zui高的恶性肿瘤，其具有发病隐匿，进展迅速的特点，仅有25%的卵巢癌能在Ⅰ期病变时被发现，大多数的患者诊断时都已扩散或转移，故卵巢癌的早期诊断对于卵巢癌患者具有重要作用。人附睾蛋白4（HE4）是近年来发现的一个新基因，大量的研究表明HE4是一个优秀的鉴别卵巢良恶性病变的生物标志物，研究人员采用Real-Time PCR技术进行检测，发现晚期卵巢癌经过手术和治疗，在复发前4~5个月就有HE4升高现象，提示HE4可用于检测卵巢癌复发。

    许多研究者认为乳腺癌是一种全身性疾病的局部表现，其治疗效果的好坏取决于确诊时是否远处转移。转移和复发是乳腺癌致死的主要原因，如果可以在亚临床状态就能检测到微转移，对临床的诊断、治疗及患者的预后都具有重要的指导性作用。早期乳腺癌复发转移的预测与防治是乳腺癌研究的前沿课题，尤其是外周血循环肿瘤细胞(CTT)及腋窝淋巴结微转移的检测逐渐成为乳腺癌研究的重点。其中常见的标志性蛋白有乳腺上皮小黏蛋白（SBEM）、细胞角蛋白19（CK19）及乳腺株细胞（hMAM）等。

    经研究表明，miR-122与肝细胞癌分型密切，miR-122表达受抑制是肝癌的特征，其主要表现为侵袭能力增强、肿瘤复发和患者生存时间减少；采用Real-Time PCR技术同时联合免疫组化等方法对miR-122表达的检测对于肝细胞癌的分型判断具有重要作用。

• 判断预后

    荧光定量Real-Time PCR技术主要通过检测化疗过程中外周血中肿瘤靶mRNA的动态变化来对化疗敏感性进行评估。化疗后CK19mRNA表达阳性的病人临床复发及病死率明显增高(P<0.001), 而无瘤生存期及总体生存率明显降低(P<0.001)。统计分析表明:荧光定量Real-Time PCR检测化疗前后外周血中CK19mRNA表达水平可作为判断乳腺癌病人预后及总体生存率的独立指标。

    研究发现对于miR-429来说，高miR-429表达与肝癌的不良预后相关。近年来也有越来越多的证据表明miR-429的表达与多种肿瘤相关，如结肠癌、胃癌、卵巢癌。

• 指导治疗

    传统的临床评定化疗敏感性方法主要是根据肿瘤的大小变化， 需要在开始治疗之后3 ～ 4mo进行。而通过检测肿瘤化疗过程中外周血中靶mRNA的动态变化可以在zui初治疗之后3 ～ 4wk尽早预测疗效, 这对于决定病人的个体化治疗具有重要意义, 尤其对于非实体瘤以及辅助化疗病人, 由于没有可测量的实体病灶, 此种评估化疗敏感性的方法显得尤为重要。

    综上所述，Real-Time PCR 是在临床上广泛应用的一种基因定量检测技术, 它不但能够准确定量肿瘤相关基因的表达量, 还可以对外周血中肿瘤标志物进行准确定量, 据此可以对肿瘤早期诊断, 肿瘤分期、分型,对肿瘤转移的早期发现及预后判断。但是我们也看到，Real-Time PCR检测存在假阳性和假阴性等问题，但相信随着科技的进步，采用Real-Time PCR技术对多个基因进行联合检测，进行综合性指标分析，或与其他一些技术诸如反转录PCR技术、免疫组化法、HE染色法等的结合应用，使得Real-Time PCR技术在临床及更多领域上将有更加广阔的应用前景。