质粒快速鉴定
试剂:
Protoplasting buffer:
30mM Tris-HCl, pH8.0 0.33ml/1.0M
5mM EDTA 0.1ml/0.5M
50mM NaCl 0.1ml/5.0M
20% Sucrose 5ml/40%
50 µ g/ml RNAseI 50ul/10mg/ml
50 µ g/ml lysozyme 50ul/10mg/ml
补水至10ml,-20℃分装保存。
Lysis buffer:
89mM Tris-HCl, pH8.0
89mM boric acid 2ml of 5×TBE
2.5mM EDTA
2% SDS 2ml of 10%
5% sucrose 1.25ml of 40%
0.04% bromphenol blue 4mg
补水至 10ml , - 20℃分装保存。
步骤:
1 .将转化后的菌液铺平板, 37 ℃ 过夜培养。
2 .配制 0 .6--0 .7% 的琼脂糖 TBE 胶。
3 .用连续加样枪在 96 孔板中每孔加入 10 µ l Photo plasting Buffer 。
4 .用灭过菌的 10ul 小枪头挑取单克隆白斑至含有 Photo plasting Buffer 的 96 孔板中,振荡混匀。
5 .用连续加样枪将 Lysis Buffer 上样于凝胶中,每孔 4 µ l ,用排枪将细胞与 Protoplasting buffer 混合液 上样于凝胶中(细胞在 Protoplasting buffer 中不宜超过 30-40 min ),并点上Marker 。
6 .调节电压为 20V (小槽)或 40V (大槽),电泳 15min ,使细胞充分裂解,将电压调高到 200V ,继续电泳 1hr ,照相。
7 .根据胶图粗略鉴定插入片段的大小及小片段率。
2 .菌落 PCR
1.取适量PCR薄壁管,置于冰上,每管先加入17.3ul的灭菌水。