实验方法原理 |
带有特异抗原的靶细胞(如正常细胞、肿瘤细胞、病毒感染细胞)与相应抗体结合后,在补体的参与下,引起靶细胞膜损伤,导致细胞膜的通透性增加、细胞死亡。染料(例如:伊红-Y、台盼蓝)可通过细胞膜进入细胞内使细胞着色,故可用于指示死细胞或濒死细胞,而活细胞不着色。此即补体依赖性细胞毒试验,利用细胞毒试验可以检查细胞膜抗原,亦可鉴定抗体的特异性。 本实验中,Thy-1抗原是小鼠胸腺T 细胞特异的表面抗原,在体外利用抗小鼠Thy-1 的单克隆抗体通过补体的协同作用,可杀伤95%以上的胸腺细胞。 |
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实验材料 | 小鼠 |
试剂、试剂盒 | Hank's液 抗小鼠Thy-1的单克隆抗体 补体 伊红-Y染液 |
仪器、耗材 | 解剖器械 平皿 不锈钢网 试管 吸量管 尖吸管 载玻片 盖玻片 |
实验步骤 |
1. 小鼠胸腺细胞悬液的制备 将 4~6 周龄小鼠采用颈椎脱臼法处死,取出胸腺放入已加入约4 ml冷Hank's液的平皿中,在100 目的不锈钢网上研磨后,过筛,放入试管,离心1000 rpm,5 分钟,用Hank’s液洗两次。将沉淀的细胞重悬于Hank's液中,配成1×107 /ml细胞悬液。 2. 取试管3 支,标明顺序,依据下表依次加入1×107 /ml胸腺细胞悬液、抗小鼠Thy-1 的单克隆抗体(最适稀释度)及Hank's液,放入37 ℃水浴30 分钟。 3. 取出后每管加入1 %伊红-Y 染液1 滴,混匀,室温放置2 分钟。
4. 重新混匀后分别在一张载玻片上滴片,加盖玻片镜检。先在低倍镜下观察,再用高倍镜观察,比较3 管中细胞死活情况。
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注意事项 |
1. 胸腺细胞制备速度要快,且需在冰浴中进行操作,以保持细胞活力。 2. 抗Thy-1 的单克隆抗体和补体的效价要在预实验中确定。 3. 细胞对照管死细胞数若超过5%,实验需重新做。 4. 细胞滴加到载玻片上后长时间放置不检测也可导致假阳性反应。
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其他 |
一、实验结果 死细胞呈红色,无光泽且肿胀变大;活细胞不着色、有光泽且形态正常。 高倍镜下计数 200 个细胞并计算其中死细胞的百分数。
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