需要掌握技能
1. 质粒转化
具体操作步骤:
将1ul 质粒DNA加入1.5ml的离心管;
将感受态细菌(competent cells)从-70℃冰柜中取出,快速吸取50ul感受态细菌,加入含质粒DNA的1.5ml的离心管;
轻轻地旋转以混匀内容物,在冰中放置30~60 min;
42度热休克90s(该时间应该非常准确,用Timer记时),冰上放置5min;
每管加500ul LB培养液,放37℃水浴1h;
吸取200ul培养物至含相应抗生素的90mm LB平板上,涂布棒将培养液涂布均匀;
倒置平皿,于37℃培养,12~16h后可出现菌落。
2. 质粒的抽提
具体操作步骤:
用前将RNase A管的液体全部加到 SolutionⅠ(加好RNaseA的溶液I一般储存在4℃);
将60ml的乙醇加到洗涤缓冲液瓶
37℃培养16h的平板中挑取一个单菌落(直径2~3mm),接种到10ml LB培养液 37℃剧烈振摇培养16 h;
取4ml菌液到5ml 离心管,8000rpm室温离心3min;
去上清,放于面巾纸上吸干痕液,
加250 ul Solution Ⅰ(注意用前应该加RNase A管),于涡旋振荡器重悬细胞;
加250 ul 37℃预热2-3min的Solution Ⅱ;
加350 ul Solution Ⅲ,将5ml离心管置于拇指和食指间柔和地反复颠倒数次;
将5ml离心管中的溶液倒入1.5ml 离心管中,
室温孵育2-3min,12000rpm 4℃离心15 min;
装配2ml 收集管(白色)和柱状收集管(蓝色)
将上清倒入柱状收集管(蓝色)中;
8000rpm室温离心3min;
去掉收集管中的液体,加500ul Buffer HB 到柱状收集管中,10000rpm室温离心1min;
去掉柱状收集管中的液体,加750ul Wash Buffer(注意用前加乙醇),10000rpm室温离心1min;
重复上述步骤一次;
不加Wash Buffer将管子10000rpm室温离心1min;
将柱状管放到一个消过毒的1.5ml 离心管中,加65ul灭菌水,室温放置2min,8000rpm室温离心3min 洗提(洗脱)DNA。
3. 质粒电泳
具体操作步骤(以倒20ml的胶为例):
用50ml量筒量取20ml 1XTAE;
用电子天平称量0.16g琼脂糖,并倒入20ml电泳缓冲液中;
将称量纸覆盖在装有琼脂糖的电泳缓冲液的三角瓶中,放入微波炉中转1min30s,至肉眼看不到颗粒状琼脂为止;
至室温待溶液冷却至60度左右,将三角瓶中溶液倒入制胶盒中,并加入上样梳子;
至室温约30min胶凝固后,拔掉梳子并将凝胶安放到电泳槽内;
向电泳槽加入电泳缓冲液,刚好没过凝胶约1mm;
将样品中加入适量的10X上样缓冲液,该上样缓冲液的体积计算如下:如果样品体积是20ul加入2ul 10X上样缓冲液,如果是30ul,加入3ul 10X上样缓冲液;
将样品加入上样槽中,打开电源,一般为120v,电泳约20-30min,关掉电源,在Dark Reader荧光透射仪观察结果。
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