转录因子Sp9参与神经纹状体苍白球发育过程（二）

对Sp9LacZ突变体中β-gal+和β-gal+/Foxp1+细胞数目统计，发现数量显著减少。由于Sp9主要在纹状体苍白球细胞中表达。所以，Sp9的缺失影响了纹状体苍白球MSNs的产生。  

对E16.5期的纹状体MSNs中10个纹状体MSN markers进行原位RNA杂交检测，发现5个纹状体黑质marker(Drd1,Tac1,Ebf1,Pdyn,Chrm4)和5个纹状体苍白球marker(Drd2, Penk, Gpr6, Adora2a, Ptprm)在Sp9LacZ/+controls中都表达。在Sp9 LacZ/LacZ突变体SVZ和纹状体中，纹状体苍白球MSN markers显著下调，qRT-PCR结果也验证了该结果。但是，纹状体黑质markers表达没有显著影响。     

对E16.5和P0期纹状体Drd2-EGFP检测，发现在突变体的SVE和纹状体中，Foxp1+/Drd2-GFP+ MSD细胞更少。因此，这些结果都显示，Sp9特异性地促进纹状体苍白球MSNs的生成。
 

研究人员接下来分析了Caspase-3表达，以检测出生后Sp9LacZ/LacZ突变鼠纹状体的细胞死亡。结果显示，突变体在出生后不同时间Caspase-3+细胞增加显著大于对照。由于在Caspase-3+细胞中并没有检测到Drd2-GFP的表达和纹状体黑质MSNs的减少，所有在Sp9突变体纹状体中，死亡的细胞为未成熟的纹状体苍白球MSNs。     

为探究突变体纹状体苍白球 MSNs凋亡是否为Bcl-2-associated X 蛋白（Bax）-依赖，研究人员构建了Sp9LacZ/LacZ; Bax-/-双突变体。结果显示，双突变体在P3期纹状体细胞死亡几乎消失，Foxp1+细胞数量明显高于单突。值得注意的是，这种增加的Foxp1+细胞并不能转化成成熟的纹状体苍白球MSNs。因此，除了促进LGE增殖和生成，Sp9还影响了纹状体苍白球神经元的分化和成熟过程。       

为进一步分析Sp9对纹状体苍白球MSNs有丝分裂期后的作用，研究人员构建了条件性敲除突变系Drd2-Cre;Sp9Flox/Flox;Rosa-YFP+小鼠。突变体中的Foxp1+和Foxp1+/GFP+细胞明显减少。在P0，P3和P5期条件性突变体Caspase-3+细胞数量也明显上升。因此，Sp9条件性缺失突变体的Drd2+纹状体苍白球MSNs的缺失与细胞程序性死亡相关，说明Sp9对于纹状体苍白球MSNs有丝分裂期后的生存相关。
 

那么，这种纹状体苍白球MSNs的缺失会造成什么样的生理问题呢？结果显示，条件性突变小鼠的移动能力受到了影响，表现出更强的移动能力。但是在旋转测试能力中并没有显著差异。因此，Drd2-Cre;Sp9Flox/Flox小鼠的快速移动能力增强，但不影响焦虑和运动协调能力。

3. Sp9作用分子机制探究        

已有报道显示Ascl1与小鼠Dre2+MSNs的生成有关。研究人员用原位RNA杂交进行了确认。与对照相比，Ascl1GFP/GFP突变小鼠中在P0期Drd2表达显著下降。在E14.5和E16.5期，Ascl1GFP/GFP突变小鼠背侧LGE SVE中的SP9蛋白与RNA表达都减少，暗示着Ascl1可以正向调控了Sp9的表达。     

为进一步验证其调控关系，研究人员分析了Sp9的启动子区域，发现有Ascl1的保守结合位点（E-box sites, CAGCTG or CACCTG）。ChIP qPCR实验表明两者确实能够结合。      

对P19期胎瘤细胞进行双荧光转录活性实验也验证了Ascl1可以通过（CAGCTG）结合Sp9 E245激活Sp9的转录。因此，这些结果表明Ascl1通过直接结合到Sp9的启动子区促进LGE SVE中Sp9的表达。

找到了上游调控因子，Sp9在下游又是影响了那些基因的表达呢？通过对Drd2-Cre;Sp9Flox/Flox条件敲除小鼠进行RNA-seq(由上海伯豪提供)，发现有90个基因发生显著变化。其中，GPCRs(Adora2a, Gpr6, P2ry1)在Sp9条件突变体纹状体中显著下调。为确认RNA-seq结果，研究人员对E16，E18，P4期小鼠进行原位RNA杂交。结果显示，他们确实都显著下调了，其中Adora2a几乎检测不到。因此，Sp9可能是影响了纹状体苍白球MSNs中Adora2a的表达。

研究结论

该研究通过表达模式分析发现了转录因子Sp9在LEG祖细胞中的广泛表达。运用Sp9-null突变小鼠，发现Sp9对于纹状体苍白球MSNs的增殖，凋亡密切相关。进一步的ChIP qPCR实验验证了Sp9受到上游Ascl1的调控。RNA-seq实验表明Sp9促进了下游GPCRsa家族蛋白的表达实现生物学功能。该研究深入理解神经节发育过程中纹状体苍白球MSNs的产生，分化和生存过程提供了新的证据。

原文出处: Zhang Q, Zhang Y, Wang C, et al. The Zinc Finger Transcription Factor Sp9 Is Required for the Development of Striatopallidal Projection Neurons. Cell Rep. 2016 ,16(5):1431-44.