酵母培养与酒精发酵

实验概要

掌握酵母培养与酒精发酵的基本原理和操作方法，了解影响酵母培养与酒精 补料分批发酵的主要因素。

实验原理

麦芽中可供发酵的物质主要是淀粉，而酿酒酵母由于缺乏相应的酶，所以不能直接利用淀粉进行酒精发酵，因此必须对原料进行预处理，通常包括蒸煮（液 化） 、糖化等处理。蒸煮可使淀粉糊化，并破坏细胞，形成均一的醪液，目前多 数厂家开始利用α-淀粉酶的液化作用来替代蒸煮过程，这样可大大减少能源消 耗。液化后的醪液能更好地接受糖化酶的作用，并转化为可发酵性糖，以便酵母 进行酒精发酵。

α-淀粉酶，又称为 1,4-α-D-葡聚糖葡萄糖水解酶，广泛存 在于动、植物和微生物体中，如麦芽或动物的唾液、脾脏中均含有较多的α-淀 粉酶，而当今α-淀粉酶的工业化生产也主要是利用微生物工程菌进行生产的。 α-淀粉酶容易溶解于水和较稀的缓冲液中，它能够切断淀粉分子中的α-1，4 糖 苷键，生成糊精及少量麦芽糖或葡萄糖，从而使淀粉遇碘变蓝的特异性颜色反应 逐渐消失，由此颜色反应消失的速度即可测出该酶的活性。 

工艺流程如下：麦芽→加水拌料→液化→糖化→发酵→蒸馏→酒精
                                                                 ↑
                                                             一级种子
                                                                 ↑
                              耐高温酒精活性干酵母→活化

发酵酒精含量的测定方法很多，如常规蒸馏法、碘量滴定法、比色法及 改良康维法等，本实验采用第一种方法。

主要试剂

12^oBx 麦芽汁培养基、麦芽汁（详见实验步骤）

主要设备

生化培养箱，摇床，离心机，分光光度计，糖份、酒精测定试剂及装置。（详见实验步骤）

实验材料

1、酵母菌种，使用前必须活化。（详见实验步骤）

实验步骤

1、培养基准备
麦芽汁培养基：将干麦芽粉，以 200g 麦芽加 700ml 去离子水，加入 1g 中温 α-淀粉酶，在 65℃水浴锅中处理 3-4h，糖化程度可用碘滴定。将糖化液用 4-6 层纱布过滤，滤液如混浊不清，可用鸡蛋白澄清，方法是将一个鸡蛋白加水约 20mL，调匀至生泡沫时为止，然后倒入糖化液中搅拌煮沸后再过滤。将滤液调 节至 pH 约 6.4。每组分装后于 121℃，15min，灭菌备用。

2、酵母活化
3%酵母粉（7.5g） ，2%葡萄糖（5g） ，溶解于 250ml 去离子水中。在 35℃复 水 20min，降温至 32℃培养 2h。

3、一级种子培养
250mL 三角瓶， oBx 麦芽汁培养基， 12 装液量 50mL； 接活化液约 4mL， 30℃， 150rpm/min 摇瓶培养 6-8h。细胞浓度达 1.5×108 个/mL 以上，无杂菌，无死细 胞。 采用血球计数法进行细菌形态观察和活菌计数，并记录实验结果。在无菌操 作台取培养液 0.5ml，加入 2 滴 0.05%美蓝染色液，置于装有 4.5ml 无菌生理盐 水的试管中摇匀。无菌操作用移液管滴取菌液于血球计数板中央，放置 3 分钟后 用显微镜观察计数，并且计算出芽率。详见《微生物学实验 P54》 。

4、乙醇发酵

①接种：按 8%接种量将一级种子分别接入至 2 只装有 100ml 麦芽汁培养基 的三角瓶中静止培养。其中，一瓶用于测定发酵参数，一瓶始终置于培养箱中培养。

②补糖：发酵前期，接种 4h 后补加 5%葡萄糖 0.2ml，以后每 2h 补加 5%葡 萄糖 0.2ml 至对数生长期后期（具体时间根据菌体生长而定） 。 发酵中后期，每 4h 可加入 5%左右的葡萄糖 2ml。

③温度：发酵前期 30℃，发酵中后期 34℃。

④细胞浓度： 发酵前期， 接种 2 小时后每小时测定一次细胞浓度至稳定期后， 再间隔 2 小时测一次细胞浓度。用血球记数板法测量菌体量及出芽率，并绘制生 长曲线。

⑤湿菌体量的计算：发酵结束，离心后，用无菌水洗涤 2 次，称量湿菌体重。

5、蒸馏,测酒精度