酶标仪测定真菌毒素检测技术的探究

　　引言 
　　粮食中的真菌毒素主要是黄曲霉毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、赭曲霉素、伏马毒素和展青霉素。真菌毒素是产毒真菌的代谢物，在适宜的温、湿度条件下，这些产毒真菌就会在粮食上生长繁殖。产生真菌毒素；真菌毒素也可能因畜禽食用了含真菌毒素的粮食而进入其乳、蛋中从而再次带入食物链。由于真菌毒素会造成人畜的致癌、造成免疫系统、泌尿系统、血液系统、肾脏等急性和慢性中毒，因此，就必须要尽量避免人畜接触真菌毒素。目前，许多国家依据公共卫生意义和商业目的，都制定了食品和饲料中真菌毒素的限量。因此需要灵敏、精确地对样品进行分析的仪器，以确保其含量低于规定的限量。下面以黄曲霉毒素的检测实验来说明酶标仪在粮食真菌毒索检测中的应用。 
　　黄曲霉毒素有极强的致癌性，长期摄入黄曲霉毒素会诱发肝癌。它诱发肝癌的能力比二甲基亚磺胺大75倍，是目前公认的致癌性最强的物质之一。另据世界卫生组织报导，黄曲霉毒素在30～50ug/kg时为低毒，50～100ug/kg时为中毒，100～1000ug/kg时为高毒，1000ug/kg以上为极毒。鉴于黄曲霉毒素对人类的巨大危害性，我国对其在食品中的含量作了严格规定，其中，乳制品中黄曲霉毒素最高允许量为5ug/kg。 
　　1 原理与方法 
　　酶标仪测定的原理是在特定波长下，检测被测物的吸光值。光通过被检测物，前后的能量差异即是被检测物吸收掉的能量，特定波长下，同一种被检测物的浓度与被吸收的能量成定量关系。检测单位用OD值表示，OD是optical delnsity（光密度）的缩写，OD＝1og（1/trans），其中trans为检测物的透光值。根据兰伯―比尔定律，OD值与光强度成下述关系：E＝OD=logΙ0/Ι，其中：E表示被吸收的光密度；Ι0为在检测物之前的光强度；Ι为从被检测物出来的光强度。 
　　OD值由下述公式计算：E＝OD=C×D×E其中：C为检测物的浓度；D为检测物的厚度；E为摩尔因子。 
　　酶标仪：即酶联免疫检测仪（ELISA Reader）是酶联免疫吸附试验的专用仪器。可简单地分为半自动和全自动两大类，但其工作原理基本上都是一致的，其核心都是一个比色计，即用比色法来分析抗原或抗体的含量。ELISA测定一般要求测试液的最终体积在250ul以下，用一般光电比色计无法完成测试。因此对酶标仪中的光电比色计有特殊要求。 
　　ELISA实验原理：用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗体的微孔中依次加入标本或者标准品、生物素化的抗体，HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物显色。底物在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的目标蛋白呈正相关。用酶标仪在（450nm）波长下测定测定吸光度，计算样品浓度。 
　　方法：国家质检总局发布的《关于印发小麦粉等5类食品生产许可证实旌细则的通知》中明确规定，黄曲霉毒素B1必须检测。在第八期《中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局公报》中发布关于黄曲霉毒素检测方法的最新国标：GB/T18979-2003《食品中黄曲霉毒素的测定免疫亲和层净化高效液相色谱法和荧光光度法》、GB/T18980-2003《乳和乳粉中黄曲霉毒素Ｍ1的测定免疫亲和层净化高效液相色谱法和荧光光度法》以上两项国标均在2003年8月1日开始实施。粮食行业执行GB/T5009.22-2003《食品中黄曲霉毒素B1的测定》第二法。 
　　1.1 酶标仪测粮食中的黄曲霉毒素含量仪器、试剂 
　　①美国热电MK3型酶标仪；赛多利斯电子天平（感量0.1克）；50微升移液器及配套吸头；恒温培养箱（0℃-50℃）；冰箱（4℃-8℃）；玻璃器皿：锥形瓶，烧杯，分液漏斗，蒸发皿，量筒，具塞试管，滴管，移液管；滤纸等。 
　　②黄曲霉毒素Bl酶联免疫定量测试盒；石油醚；甲醇；蒸馏水。 
　　1.2 实验步骤 
　　1.2.1 样品处理方法：称5.0g样品（已粉碎）于100ml具塞三角瓶中。准确加入25.0ml甲醇水（1+1）溶液，加塞振摇15min，弃去1/4初滤液，收集试样滤液，此液为样品提取液。假设样品不需稀释，此液则为待测样液。 
　　1.2.2 试剂的配制 
　　①每瓶C试剂（酶标抗原）中准确加入1.5mlD试剂(酶标抗原稀释液)，充分溶解，配成实验用酶标抗原溶液，2℃～8℃保存。 
　　②取适量E试剂（浓缩洗涤液）用蒸馏水稀释20倍待用。 
　　1.2.3 操作流程：样品提取，适当稀释，试剂准备，加样，在温度37℃下进行免疫反应30min，然后在37℃下进行显色反应15min，结果判定，计算含量。 
　　2 结果计算 
　　建立公式：X（ng/g）=C××D 
　　式中：X：黄曲霉毒素B1含量（ng/g）； 
　　 C：待测样液中黄曲霉毒素Bl含量（ng/m1）； 
　　 V：样品提取液体积（m1）； 
　　 M：样品质量（g）； 
　　 D：样品稀释倍数。 
　　3 酶标仪的使用注意事项 
　　3.1 工作环境 酶标仪是一种精密的光学仪器，因此良好的工作环境不仅能确保其准确性和稳定性，还能够延长其使用寿命。 
　　①仪器应放置在无磁场和干扰电压的位置。 
　　②仪器应放置在低于40分贝的环境下。 
　　③为延缓光学部件的老化，应避免阳光直射。 
　　④操作时环境温度应在15℃－40℃之间，环境湿度在15％－85％之间。 
　　⑤操作电压应保持稳定。 
　　⑥操作环境空气清洁，避免水汽，烟尘。保持干燥、干净、水平的工作台面，以及足够的操作空间。 
　　3.2 操作注意事项 酶标仪的功能是用来读取酶联免疫试剂盒的反应结果，因此要得到准确结果，试剂盒的使用必须规范。在酶标仪的操作中应注意以下事项： 
　　①使用移液器加液，移液头不能混用。②洗板要洗干净。如果条件允许，使用洗板机洗板，避免交叉污染。③严格按照试剂盒的说明书操作，反应时间准确。④请勿将样品或试剂洒到仪器表面或内部，操作完成后请洗手。⑤如果使用的样品或试剂具有污染性、毒性和生物学害，请严格按照试剂盒的操作说明，以防对操作人员造成损害。⑥不要在测量过程中关闭电源。⑦对于因试剂盒问题造成的测量结果的偏差，应根据实际情况及时修改参数，以达到最佳效果。⑧使用后盖好防尘罩。 
　　3.3 阈值可疑范围的设定 一般酶标仪阈值矩阵设定可设定阴性、可疑、阳性3个范围。有经验表明可疑范围的设定要设定为临界上下15%（也称灰色区）为宜；同时阴性范围下限和阳性范围应该充分考虑到影响ELISA结果因素的存在，可疑范围上限必须考虑到双波长情况下出现负吸光度值和超范围报告影响结果的可能性。“灰色区”的结果的真实性是ELISA定性测定中最需要把握的环节，也是实验室引起医疗纠纷的主要方面，因此必须对可疑结果进行复检，最好用两种试剂盒。 
　　3.4 样本名字文件设定 由于部分试验的所测样本不一定是连续，样本命名显得尤为重要。同时应做到样本名字文件与吸光度值文件保持一致，这样若以后再调出吸光度文件时，样本名字文件可自动同时调出；若大批量样本时应对不同微孔板编号区别（以文件后缀形式）。 
　　3.5 样板程序文件设定 一个实验室同一试验可能使用不同厂家试剂盒，但不同试剂盒规定的设定对照数量、阈值判定标准等均可能不一致，酶标仪所设样板程序也不一致。为了使用方便，可在样板程序文件中用后缀加以区别。 
　　3.6 记录管理 随着我国法律的不断完善，人们的法制观念不断增强，建立健全原始记录十分重要和必要。原始记录不仅是仪器打印出来的数据，还应记录试剂盒厂家、批号、效期、质控物来源、批号、效期、检测者、复核者等相关内容，同时可用原始记录进行资料分析，更好地开展工作。但要注意的是原始记录不宜保存在电脑内，应打印后装订保存。