酶联免疫斑点(ELISPOT)测定法

酶联免疫斑点(ELISPOT)测定法是一种在单细胞悬液中检测分泌某种特定蛋白质的细胞和定量分析产生该特定蛋白质的细胞频率的有力工具。1983年，Crekinsky等运用ELISPOT技术成功检出分泌特异性抗体的细胞频率，经过不断发展，目前该技术已广泛用于检测产生、分泌多种其他效应分子的细胞(如细胞因子)。此方法操作简便，但却能提供非常类似于体内实验的环境，监测T细胞分泌的各类细胞因子，预测体内免疫系统相应的进一步免疫反应。在美国国家卫生研究院的国立过敏和传染病研究所的HIV疫苗试验网络(HVTN)与疫苗研究中心(VRC)的实验室，ELISPOT方法被标化和验证，已经用作检测艾滋病毒疫苗免疫原性终点的一个主要方法。

基本原理和实验方法及注意事项

1．基本原理和实验方法

ELISPOT检测的是可释放细胞因子的活化T淋巴细胞的数目。在ELSPOT方法中，硝酸纤维素膜的96孔板中预先包被了抗细胞因子的抗体，T细胞和抗原或肽段共同在板孔中孵育，受到刺激后的T细胞会产生细胞因子，分泌的细胞因子因与板孔中预先包被好的抗体发生结合而聚集在细胞所处部位，再加入酶标记的二抗，最后加入底物，就会形成不可溶的带有颜色的斑点，一个斑点代表着一个能够产生细胞因子的细胞，这种方法较ELISA敏感200倍，无放射性，可以定量分析，精确性同LDA相当(Miyahira et al_，1995)。

ELISPOT方法的基本原理一样，但仍然会有一些变化，包括效应细胞的种类，可以是外周血T淋巴细胞，也可以是体外培养的T细胞。抗原刺激物可以是肽或者蛋白质，抗原呈递细胞有外周血单核细胞、树突状细胞或者肿瘤细胞系，检测的指标可以是各种细胞因子或者颗粒酶B等。图10．7说明了ELIPOT的原理和流程。

2．ELISPOT实验注意事项

(1)ELISPOT试验的检测样品和样品的收集

ELISPOT试验在体外模拟体内的环境，检测活化的免疫细胞分泌细胞因子的状况，因此其检测对象是具有功能的细胞。对于人、猴等灵长类动物，一般采用外周血新鲜分离后的单个核淋巴细胞，对于小鼠则多采用脾脏细胞。细胞的分离、保存、复苏、培养、运输以及检测环境和具体的操作等多个环节都可能会影响细胞的活力和功能，如果不能确保细胞的活力和功能，便不能得到免疫细胞分泌细胞因子的真实试验结果。目前外周血单个核细胞的分离方法通常是加入无钙的PBS等渗缓冲液倍比稀释外周血后，应用淋巴细胞分离液分离出细胞，整个操作过程必须在无菌条件下完成，往淋巴细胞分离液中加人稀释的全血时应缓慢滴加，并且在整个操作过程中都应该轻拿轻放，避免人为地将稀释全血与分离液混合。外周血一经采集应该立即进行分离，据文献报道，在室温下储存12h以上，再分离外周血单个核细胞，细胞的活力将有所下降(Kierstead eta1．，2007)。

分离后的细胞应该尽快进行ELISPOT试验，否则需要用相应的冻存方法将其放置在液氮内保存，研究表明，在液氮内保存180天的外周血单个核细胞，复苏后细胞的活性保持在80％以上，并且ELISPOT试验的结果与新鲜分离细胞保持一致(Smith eta1．，2001)。目前许多疫苗的临床试验需要将不同地区的样本集中在中心实验室检测，因此细胞的冷冻保存为此奠定了基础，通过液氮运输冻存的细胞保证了疫苗临床试验的完成。细胞运输过程中温度的波动变化是影响细胞活力的关键因素，为保证运输和保存细胞温度的一致性，应使用液氮进行运输。

(2)ELISPOT试验中阴性对照、阳性对照以及试验孔的刺激物

通常免疫试验都需设立阴性对照和阳性对照，ELISPOT试验也是如此，其阴性对照为试验细胞加上培养基，阳性对照为试验细胞加上阳性刺激物，同时应设立完全培养基对照，对于人、猴等灵长类动物，阳性刺激物可以选择葡萄球菌肠毒素(staphylo-coccal enterotoxin B，SEB)、植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)、CEF肽库或者PMA和ionomycin(或A23187)的混合物。CEF是含有32条巨细胞病毒(cy-tomegolo virus，CMV)、EB病毒(epstein-barr virus，EBV)和流感病毒(inflLlenzavirus)来源的T细胞MHCⅠ类分子表位肽的混合物，其刺激反应是一种特异性的反应，与体外给予特异性肽段或抗原的刺激效果类似，并且不同的人对CEF的反应不同(Mwau and McMichael，2002)。小鼠脾脏细胞多选用刀豆蛋白A(ConA)作为阳性刺激物。如果对阳性刺激物缺乏反应，说明细胞在冻存或者复苏中受损，该试验细胞则不能进行ELISPOT试验。一般可以大量采集对以上刺激物有反应的细胞，进行分离冻存，在每次实验时都复苏细胞进行平行实验作为阳性对照，并且该阳性对照也可以作为ELISPOT质量控制的指标。试验孔细胞的刺激物为根据试验的要求设计的特异性抗原或者肽库，其刺激浓度根据抗原和肽库性质纯度而定，一般情况下，肽库的工作浓度为2ug／ml，蛋白质的工作浓度为10ug／ml，实际工作中可以通过预试验摸索得到最佳条件。

(3)试验中其他因素对实验结果的影响

目前ELISPOT检测试剂有已经包被好细胞因子捕获抗体的反应板，也有需要预先包被抗体的试剂，不同包被抗体的浓度会影响最终反应的斑点，如果包被抗体的浓度过低，反应斑点偏大，并且有弥散现象，随着抗体浓度的增加，反应斑点会逐渐清晰致密，因此，在每次试验前需要预先摸索包被抗体的浓度或者根据说明书的建议进行试验。试验孔细胞的数量会影响ELISPOT的试验结果，一般每孔细胞的数量在20万～40万可形成最大密度的单层细胞(Smith et a1．，2001)。根据不同的试验刺激物，可以相应地调整试验孔细胞的浓度，在非特异性刺激物(SEB、PHA、PMA、ionomycin或者ConA)的作用下，一般每孔细胞数量为0．5万～5万个，在特异性刺激物CEF肽库、相应的抗原或肽库的作用下，一般每孔细胞数量为5万～40万个(Sylvia et a1．，2006)。

大多数细胞可以直接进行ELISPOT试验，不需要预先孵育，但是预先将细胞和刺激物进行孵育，可以有效地去除巨噬细胞和粒细胞对实验结果的影响，同时对于IL-10或者颗粒酶等，采用直接法很难得到较好的试验结果，必须通过预孵育法才能得到较好的试验结果。有文献报道，冻存的细胞如果预先过夜孵育，可以更加有效地去除凋亡细胞的干扰(Marta et a1．，2007)。

细胞加入ELISPOT反应板与刺激物共孵育的时间，一般在16h以上，最长可孵育至24h或更长。此外，在向反应孔中加入细胞时应缓慢垂直滴加，避免细胞聚集在板孔边缘，建议每次实验时先加入反应刺激物后再加入细胞。对于底部为PVDF膜的反应孔，在加样时应该避免接触板孔的底部，以免损坏PVDF膜。在细胞加人反应板后，应该尽量避免振摇反应板，防止反应斑点的拖尾现象。虽然ELISPOT试验相对其他细胞免疫检测方法的操作步骤已经相对简单，其操作步骤几乎和ELISA反应相似，但是在其洗板的过程中仍然需要小心处理，目前有手工洗板和机器洗板，在手工洗板的过程中，每次洗板后，应该轻扣反应板以去除板孔内多余的水分，猛烈扣板可能会导致反应斑点的脱落。机器洗板可增加试验效率，并且在进行具有感染性试验时可以保证实验人员的安全，但是并不能保证无菌操作，因此在细胞孵育之前的洗板步骤需要手工洗板。此外，培养基的类型可以影响整个反应的背景，如果选择无血清的培养基可能会降低反应孔的背景。

在ELISPOT的操作过程中，试验中应用的培养基、包被抗体浓度、检测抗体浓度、孵育时间、洗板的操作及显色的时间等每一个试验环节都有可能影响试验的结果，每个操作者可以根据实验室的条件建立相应的ELISPOT反应条件，从而得到较理想的试验结果。值得注意的一点是，不同实验室对于同一种细胞因子需要进行各自试验条件的摸索，同一个实验室在检测不同细胞因子时，同样应该针对每一种细胞因子的试验条件进行探索。

(4)ELISPOT实验结果的判断、分析以及阳性的判断标准

ELISPOT方法的缺点在于：人工操作计数造成的误差、点的大小形状变化造成的误差以及实验操作者主观操作造成的误差都会影响实验结果。目前已有商品化计算机成像分析系统，大大增加了计数免疫斑点的精确性和速度。其中美国CTL公司产品占有率较高。通过分析斑点的形状、大小、密度，可以排除非特异性斑点和确定单个T细胞产生的细胞因子的量。

ELISPOT、试验已经广泛地应用在HIV疫苗的临床试验中，用于评价HIV疫苗诱导的细胞免疫效果。ELISPOT试验结果阳性的判断标准目前分为三类：经验标准、Permutation-based resampling标准和Distribution-free resampling标准(Zoe et a1．，2006)。

经验标准的具体规定为：在每孔20万个细胞中，加人相应抗原或肽段刺激的反应孔斑点形成细胞(SFC)的平均数量至少为11个，并且是阴性对照孔SFC平均数量的4倍，如果符合上述两个条件，则试验组为阳性反应。经验标准是试验者根据ELISPOT、的试验经验得到的判断阳性的标准，应用相对简单，但是存在一些不可避免的缺点，如经验标准的准确性较差，根据经验标准得到的结果往往特异性和灵敏度都相对较差。ELISPOT、试验的操作方法的各项条件是多样化的，每个实验室都不是完全相同的，而经验标准往往是根据某一特定试验条件所制订的标准。严格地讲，试验条件完全相同的实验室才可以按照该标准进行判断，如果试验条件不同的实验室都参照经验标准来判断疫苗的细胞免疫效果，可能有些实验室的判断结果会有不准确的信息存在。

Permutation-based resampling标准在经验标准的基础上应用了统计学方法，相对地校正了经验标准的一些缺点。该标准的具体规定为：根据T=(YE-YC)/Sp得到P值，从而判断结果。YE代表相应抗原或肽段刺激的反应孔斑点形成细胞(SFC)的平均数量，YE至少为10SFC/200 000个PBMC，Yc代表阴性对照孔SFC平均数量，SP代表标准差，应用该标准在一定程度上提高了检测的特异性。

Distribution-free resampling标准是一种更新的阳性判断标准，结合了统计方法，计算比Permutation-based resampling标准更为简单，并且该方法在一定程度上避免刺激肽库中不同肽段的相互影响，可以更好地应用在疫苗的临床试验上。