一、ELISPOT包被 1. 设计好实验,把每个孔要加入的内容做成卡片,到时候就会从容很多。 2. 每孔加入15 μL 70%的乙醇预湿30秒。 3. 加入100 μL去离子水洗涤三次,尽量减少乙醇的残留。 4. 按照试剂盒的使用说明,将包被抗体储存液稀释在PBS缓冲液中,每孔加入50 μL,4°C包被过夜。 5. (次日)倾倒包被液,用PBS洗涤5次,最后一次,在灭菌的吸水纸上扣干。 6. 加入200 μL试剂盒自带的稀释好的封闭液,37°C封闭1小时。 7. 倾倒封闭液,无须洗涤,直接可以进行细胞培养。(也可以用PBS缓冲液或者纯水洗涤一次,拍干,封口,4°C保存,可以在4°C保存数周。) 二、铺细胞,加入刺激物,培养 整个实验设置一组正对照(PHA刺激),每一个细胞样品(同一个捐献者或者实验动物)要设一个负对照(不加刺激物),整块板还要加一个背景负对照(不含细胞,只加培养基和所有的检测试剂)。 1. 填好实验卡片,用以指导实验的安排和细胞及试剂的添加。每一个细胞/刺激物的组合设置2-4个孔的重复(想要有统计学的意义,每个细胞/刺激物设4个孔的重复)。 2. 取出封闭好的板,准备加入细胞。如果是以前做的封闭,可以加入200 μL的U-Cytech无血清培养基,室温静置10分钟,倾倒,然后再重复一次。 3. 按照实验卡片的安排,加入不同浓度的细胞,100 μL/well,细胞在孔中的分布要尽量均匀(要诀是加入细胞之后,不要再震动或者拍击ELISPOT板。有人认为拍击板子会让细胞更分散,实际情况刚好相反)。正对照的细胞浓度为1x105/well,实验组的样品细胞浓度请自行调整。 4. 加入100 μL的U-Cytech无血清培养基到背景负对照孔。 5. 正对照孔加入10 μL PHA,终浓度4 ug/mL,该浓度能有效刺激IFN-γ的分泌。 6. 加入实验者自己的刺激物(配制成10×终浓度,10μL/well)到实验孔。加完刺激物之后不要再拍击ELISPOT板。 7.当加完所有的样品之后,盖上板盖,放入二氧化碳培养箱,37°C培养18-24小时。 三、培养后操作 1. 倾倒孔内的细胞及培养基。 2.低渗法将细胞裂解,每孔加入200 μL冰冷的去离子水,将板置于冰上冰浴10分钟。 3.每孔用200 μLPBST洗涤10遍,洗涤最后一遍之后,将板倒扣在吸水纸上拍干。 4.按照试剂盒说明的浓度,用抗体稀释液稀释检测抗体,每孔加入100 μL生物素标记的检测抗体,37°C1小时。 5. 每孔用200 μL PBST洗涤5遍,洗涤最后一遍时,将PVDF膜板的背面的塑料保护层取下,同时洗涤膜的正反两面,盖上保护层,将板倒扣在吸水纸上拍干。 6. 按照试剂盒说明的浓度,用抗体稀释液稀释酶标的链霉亲和素,每孔加入100 μL,37°C1小时。 7. 每孔用200 μLPBST洗涤5遍,洗涤最后一遍时,将PVDF膜板的背面的塑料保护层取下,同时洗涤膜的正反两面,盖上保护层,将板倒扣在吸水纸上拍干。 8. 照试剂盒的说明,解冻已配好的AEC显色液。每孔加入100 μL的显色液,室温静置20-30分钟,注意避光。 9. 待斑点生长到适合的大小之后,以去离子水洗涤2遍,终止显色过程。将板倒扣在吸水纸上,拍干细小的水珠,之后取下保护层,放在通风的地方,室温静置10-30分钟,让膜自然晾干。注意不要将板放到烤箱内,防止膜发脆、破裂。 10. 将ELISPPOT板置于ELISPOT自动读数仪内,调节好合适的参数,半点计数,并记录斑点的各种参数,作统计分析。 展开 |