酿酒酵母培养条件实验

酵母在琼脂或液体培养基中的理想培养温度是30℃，培养皿平板应倒置放入塑料盒中，于孵箱或培养室内进行培养。当孵育时间超过2或3天时，塑料盒可防止平板上的琼脂干裂。当使用液体培养基培养时，要使用旋转式或往复式摇床，至少每分钟200转，以保证充分通气；进行大体积液体培养时使用锥形瓶，培养基为瓶容积的1/5到1/3。虽然带三重挡板的摇瓶比较昂贵，但每瓶有较多培养基时细胞生长良好。5~10ml的小量培养，可以使用玻璃试管或塑料试管，放入固定于揺床平台上的倾斜支架内，这样可获得最好的通气„ 用灭菌的15mm x 100mm的一次性塑料管进行培养，培养基的量最多为2ml; 而用20mm x 150mm带塑料盖的玻璃管进行培养，培养基的量最大可到10ml。

可用接种环或灭菌的牙签接种平板或液体培养基，一般使用直径为2~3mm的铂或镍接种环。灭菌扁平牙签的大头也可用于酵母细胞的划线接种，以获得单菌落。牙签还可用于重复操作，如多次接种或在方格网上的菌落点斑接种以便进一步的研究等。牙签应宽头朝下放人玻璃样品瓶（24mmx 62mm)，用 Morton培养管罩子(直径25mm) 盖上，高压灭菌。

YPAD 过夜培养物 酿酒酵母

YPAD 或 SC 减样选择培养基 甘油

平板 分光光度计 天鹅绒

在复合培养基如YPAD中，当接种足量的细胞并于30℃培养过夜（16小时），使其分裂10代，大多数酵母菌株滴度可达2 x 108到3 x 108个细胞/ml; 而在合成培养基如SC减样选择培养基中，细胞滴度为1 x 107到2 x 107个细胞/ml。可以用几种方法来检测培养物的滴度，如测定600nm处的光密度（OD600)，或用血细胞计数器和显微镜进行细胞计数。对大多数菌株来说， OD600为0.1相当于细胞滴度为1x106个细胞/ml。用血细胞计数器检测细胞密度比较费时间，但可以直接观察酵母细胞，这样可以识别健康与污染的培养物。

一、分光光度测定法

1. YPAD 过夜培养物用水 100 倍稀释，而 SC 减样选择培养基过夜培养物 10 倍稀释。

2. 用分光光度计测定 600 nm 处的光密度。

3. 记住稀释倍数，计算原始培养物的细胞数。

二、血细胞计数器计数法

在任何种类固体培养基上的酵母菌落可以被影印培养到其他种类的培养基中，以便进行特定表型的筛选或鉴定。有代表性的做法是用一个自制的复制器具进行，它由一个直径77mm的木头或金属圆柱体和一个配上去稍大的内径80mm的金属环构成。将一块15cmx15cm见方的棉制天鶴滅在圆柱体上展平，并用金属环固定，以作为复制介质。一平方米天鹤绒可制成大约36块，洗涤后置于平面上于室温干燥，用棉絮辊去掉棉絮，绒面向下放入灭菌盘或其他合适的容器中，高压灭菌。

1. YPAD 过夜培养物用水 100 倍稀释，SC 减样选择培养基过夜培养物不进行稀释而直接计数。

2. 将细胞悬液小心地加在盖片和血细胞计数器之间。

3. 计数 5 个对角方格中的细胞数量，乘以 5 即是整个网格区细胞的总数。

4. 计算细胞滴度：计数的细胞数 X 5 X 稀释倍数 X 1/血细胞计数器 25 个方格的容积。

1. 对于处于对数生长期的培养物不必进行稀释。

2. 酿酒酵母是以母细胞发芽的方式进行分裂，因此将发芽的细胞计数为一个单细胞。只有当细胞上形成明显的另外的芽时，才能按相同芽大小计数为两个细胞。一些菌株形成细胞丛，这会降低涂板效率，一丛细胞在平板上只能长成一个菌落，使进一步的分析复杂化，在超声水浴中对培养物进行3分钟的超声处理，可以减少该菌株的成丛性。

3. 将用过的方天鹅绒浸人水中过夜，用刷子轻轻刷洗以去掉残渣，在干净的水中漂洗干净后，置于平面上晾干。由于酵母对肥皂和去污剂非常敏感，因此不要用它们来洗涤天鹅绒。

疑难解析：污染

1. 即使悉心按微生物无菌技术进行操作，有时培养物和培养基也会被污染。因此，平板和液体培养基在使用前要检査，一旦污染就扔掉。

2. 酵母菌落有确定的形态特征和表面结构，平板或液体培养物有一种残余的烘烤或酿造气味。细菌污染通常导致腐臭味；真菌污染在平板上长成丝状菌落，在液体培养基中形成毛茸茸的团块。如果你认为培养物被污染，最好取点样品涂在载玻片上并在显微镜下检查。

3. 重要的酵母菌株可以通过从污染的平板上细心分离样品并在新平板上划线培养进行挽救。

本实验来源《细胞实验指南》 黄培堂 等译。