铁蛋白免疫电镜技术

一、 原理

免疫铁蛋白技术是以铁蛋白标记抗体，再以铁蛋白抗体与待检抗原作用。通过电镜检查，观察到铁蛋白抗体所在的位置，即抗原所在。

二、材料与试剂

1．马脾铁蛋白

2．硫酸铵

3．硫酸镉

4．双异氰酸镉二甲苯(Metaxylene dlisocyante  XC)以0.30Mol/L pH 9.5硼酸盐缓冲液将XC配制成1%溶液。注意配制的水及容器必须特别清洁，配制后放置4℃数天，以不出现沉淀为准。如出现沉淀XC的多聚体形成，应重配。

5．0.30Mol/L pH 9.5硼盐酸缓冲液

6．0.1Mol/L硫酸铵液

7．0.05Mol/L pH 7.4 PBS液

三、操作方法

1．铁蛋白的提取

① 配制2%硫酸铵液，并以1Mol/L的NaOH或HCl调pH值，正好为5.85。取1g铁蛋白溶于100ml的2%硫酸铵液中。

② 加入20%硫酸镉，使最终浓度为5%，混匀，4℃过夜。

③ 1 500g离心(4℃)2h，去上清。仍加2%硫酸铵至100ml，混匀，离心，去除不纯沉渣。

④ 于上清液中重新加入20%硫酸镉，重复步骤⑵，离心，去上清。

⑤ 检查沉渣，置显微镜下检查，应具有典型的黄褐色结晶，结晶为六角形，双一四点结构，如结晶不典型，应继续重复以上步骤。

⑥ 以少量的蒸馏水溶解，再加50%饱和硫酸铵溶液，使之沉淀，离心，去上清。

⑦ 重复步骤⑹一次。

⑧ 以少量蒸馏水溶解,常水透析24h后,以0.05Mol/L pH 7.5PBS透析24h。

⑨ 100 000r/min离心2h，去除上部无色上清液(约3/4总量)，置4℃过夜。

⑽ 用微孔滤膜(孔径0.45μ)过滤，使铁蛋白含量为65mg/ml～75mg/ml，分装，4℃保存不要冻干保存,以免铁蛋白结构遭破坏。

2．铁蛋白－抗体交联法

① 以0.3Mol/L pH 9.5硼酸盐缓冲液将铁蛋白稀释成20mg/ml～25mg/ml。

② 以1︰1000(W/W)的比例加入XC液室温搅拌45min，离心去沉淀。

③ 以0.3Mol/L pH 9.5硼酸盐缓冲液将提纯lgG配成5mg/ml，以1︰4的比例(V/V)加入IgG与铁蛋白－XC液，4℃搅拌48h。

④ 以0.1Mol/L碳酸铵溶液透析过夜，以除去多余的异氰酸盐，再以0.05Mol/l pH 7.5 PBS透析，使pH值恢复到生理水平。

⑤ 超速离心  以1.00×105g离心5h，去上清，沉淀以0.05Mol/L PBS悬浮，再次离心，以除去未结合的IgG。

⑥ 以血清学及免疫学方法测定结合抗体的特异性、免疫活性以及标记效应，如果操作步骤严格，结果是满意的。

3．铁蛋白－抗体结合物处理标本

① 将标本以5%福尔马林pH 7.2(4℃)PBS液固定40min～60min。

② 用冷的PBS液洗涤，离心。

③ 如是组织块，则在解剖显微镜下切成更小块，放入试管中，加入铁蛋白－抗体结合物置室温20min，不时振荡,

④ 以冷PBS液洗涤三次，离心。

⑤ 沉淀以2.5%戊二醛固定20min，以PBS洗涤。

⑥ 再以锇酸固定，脱水包埋。

也可以先超薄切片，再进行铁蛋白－抗体结合物染色。操作如下：

① 将培养细胞以1%福尔马林PBS液固定(4℃)。

② PBS液洗涤离心。

③ 以0.5ml,30%牛血清蛋白PBS液悬浮置入胶透析膜袋中，再将袋置于吸水剂粉末上，待牛血清白蛋白成胶状物时，将透析袋移至2%戊二醛PBS液（pH7.5）中固定3h。

④ 取出，切成小块，以PBS液洗涤。

⑤ 置干燥器中以硅胶干燥。

⑥ 包埋、切片、在水上收集切片置于经4%牛血清白蛋白PBS液处理的披有胶膜的载网上(牛血清白蛋白的处理在于减少铁蛋白结合物非特异性吸附于载网上)。

⑦ 滴一滴铁蛋白－抗体结合物于载网上。

⑧ 5min后，浮网于PBS液面,标本面向下，以除去多余的结合物。

⑨凉干后，滴一滴乙酸双氧铀或氢氧化铅以复染。水洗、晾干、电镜观察。

四、结果判定

在已知对照样品成立的前提下，凡是出现黑色的铁分子颗粒即表示抗原的存在，判定阳性(＋)，否则判为阴性(－)