实验方法原理 许多真核生物的基因所包含的 DNA，远非单个重组子所能容纳得了的。对于大多数染色体来说，更是如此。因此，必须构建一套重叠的 DNA 克隆，这些克隆的 DNA 按次序排列能形成叠连序列（叠连群），可以涵盖一个很大的基因或目的区域。
实验材料 T4 噬菌体 DNA 连接酶限制性内切核酸酶 PstⅠ或 NsiⅠ耐热性 DNA 聚合酶模板 DNA
试剂、试剂盒 扩增缓冲液dNTP 溶液乙醇酚氯仿醋酸钠T4 DNA 连接缓冲液
仪器、耗材 琼脂糖凝胶核酸和寡核苷酸寡核苷酸盒带过滤层吸头薄壁微量离心管移液器程控式 PCR 仪水浴或冷却装置
实验步骤
一、材料
1. 缓冲液和溶液
10X 扩增缓冲液
dNTP 溶液（1 mmol/L，包括所有 4 种 dNTP ( pH 8.0；PCR 级)
乙醇
酚：氯仿（1:1, V/V）
醋酸钠（3 mol/L, pH 5.2）
10X T4 DNA 连接缓冲液
2. 酶及其缓冲液
T4 噬菌体 DNA 连接酶
限制性内切核酸酶 PstⅠ或 NsiⅠ
耐热性 DNA 聚合酶
3. 凝胶
琼脂糖凝胶
核酸和寡核苷酸
寡核苷酸盒 [ 5.0 OD260/ml (~8.5 μmol/L)]，用 TE ( pH 7.6) 溶解 5'CATGCTCGGTCGGGATAGGCACTGGTCTAGAGGGTTAGGTTCCTGC TACATCTCCAGCCT TGCA3'
寡核苷酸（接头）引物 [ 5.0 OD260/ml (~17 μmol/L) ], 用 TE ( pH 7.6 ) 溶解。 5'CATGCTCGGTCGGGATAGGCACTGGTCTAGAG3'
序列特异性寡核苷酸（载体) 引物 [ 5.0 OD260/ml (~17 μmol/L) ]。用 TE ( pH 7.6 ) 溶解。
模板 DNA: 重组 BAC、YAC 或黏粒 DNA
4. 专用设备
自动移液器用的带过滤层吸头
扩增用的薄壁微量离心管（0.5 ml)
阳性对照专用的移液器
储存有扩增程序的程控式 PCR 仪
15℃ 水浴或冷却装置
二、方法
1. 用 PstⅠ或 NsiⅠ消化约 5 μg 模板 DNA。取一小份反应产物，进行琼脂糖凝胶电泳，以确证所有的 DNA 都已经被酶解。
2. 用酚: 氯仿抽提混合液及标准的乙醇沉淀法回收 DNA，然后用 70% 的乙醇洗涤沉淀。将管子开口倒扣在一叠卫生纸巾上，使最后残留的乙醇挥发，然后用 50 μl H2O 溶解湿润的 DNA 沉淀。
3. 在一个无菌的 0.5 ml 的微量离心管中，依次加入下列物质：10X T4 DNA 连接酶缓冲液 10 μl，消化后的 DNA 模板 20 μl，寡核苷酸盒子 5.0 OD260/ml 2 μl，T4 噬菌体 DNA 连接酶 5 Weiss 单位/μl 2 μl，加水至 100 μl。
设 3 个对照管，对照管的体系参照上述配方。其中一个无模板 DNA，另一个无寡核苷酸接头，第 3 个无 T4 DNA 连接酶。
4. 将实验管及对照管在 15℃ 下连接 12~16 h。
5. 在一个无菌的 0.5 ml 的微量离心管中，依次加入下列物质：10X 扩增缓冲液 2 μl，1 mmol/L 4 种 dNTP 混合溶液（pH 7.0） 2 μl，接头的寡核苷酸引物 5.0 OD260/ml 1 μl，载体的寡核苷酸引物 5.0 OD260/ml 1 μl，取自步骤 4 的实验管 DNA 连接产物 1 μl，耐热 DNA 聚合酶 5.0 单位/μl 0.5 μl，加水至 20 μl。
设 3 个 PCR 对照。每只对照管中含有连接反应中相对应的对照反应液 1 μl。
6. 如果 PCR 仪没有高温顶壳，在反应混合体系里加一滴（约 50 μl）轻矿物油，以防止加热和冷却循环时样品的蒸发。另外，如果用热启动则加一滴石蜡。
7. 将 PCR 管放入 PCR 仪中，按下表输入程序后，开始扩增。
