高效液相色谱之高效排阻液相色谱

高效液相色谱（High Rerformance Liquid Chromatography, HPLC）又叫高压、高速、近代液相色谱，通常叫做高效液相色谱。它是60年代中期才建立的一种高效快速分离化合物的方法，到了70年代后期才广泛用于蛋白质的分离纯化方面，现已成为分离纯化蛋白质非常有效的方法之一。

和经典常压色谱相比它有以下特点：
1、HPLC分离、纯化蛋白质的速度快。通常半小时左右可进行一次，大大缩短了纯化蛋白质的时间；
2、分辩率高。一根长10cm的色谱柱可分离十几种以上的物质；
3、适应面广，灵活性强，几乎所有的蛋白质根据它们的性质差别（等电点、疏水性、分子量、电荷分布等）都可以用不同HPLC方法进行分离提纯；
4、灵敏度高。HPLC现已广泛采用多种高灵敏度的检测器，如紫外、荧光、电导等。荧光的灵敏度可达10-9g；
5、重复性好，在作分析蛋白质分析试验时，误差一般不超过5%。
因此，HPLC在蛋白质分离纯化方面具有极其重要的位置。

当然HPLC也有它的缺点，例如，仪器设备价格昂贵，虽然已有制备柱使用，但制备量还是受到限制，在某些方法中，由于使用有机溶剂，对蛋白质的活性会有一定影响。

高效液相色谱仪是高效液相色谱的专用仪器，有很多种类，从类型看分为综合型高效液相色谱仪和专用型仪器，从功能上分为分析型、制备型、分析和制备兼用型。

一般高效液相色谱仪主要有以下部分组成：

1、输液泵，为色谱柱输送液体；
2、进样器；
3、色谱柱，对样品进行分离；
4、检测器，对分离后样品进行检测；
5、记录器（数据处理和打印部分），对检测到的信号进行处理和记录；
6、程序控制器，对各部分进行程序控制，例如输入色谱条件、参数等。另外，常配有贮液装置、脱气装置、分部收集器等。

根据分离模式的不同，高效液相色谱通常分为以下几种模式：
1、高效排阻液相色谱，按蛋白、多肽分子量大小进行分离；
2、高效离子交换液相色谱，按蛋白质、多肽带电不同而进行分离；
3、高效反相液相色谱，按蛋白质、多肽的疏水性不同而进行分离；
4、高效疏水作用液相色谱，其原理与反相色谱相同。区别在于疏水色谱的填料表面疏水性没有反相介质的强；
5、高效亲合液相色谱是利用生物大分子和固定相表面存在某种特异性吸附而进行选择性分离的一种生物大分子分离方法。

高效排阻液相色谱

又叫体积排阻色谱（Size exclusion chromatography, SEC），分子筛色谱（molecular sieve chromatography），凝胶过滤（gel filtration）等，生化界常用凝胶过滤。SEC是一种纯粹按照溶质分子在流动相溶剂中的体积大小分离的色谱法，填料具有一定范围的孔尺寸，大分子进不去而先流出色谱柱，小分子后流出。用于生物大分子分离的传统SEC填料主要是多糖聚合物软胶，只能在低压下作慢速分离用。目前在很大程度上被微粒型交联的亲水凝胶（如交联琼脂糖Superose6和12），乙烯共聚物（如TSK-Gel PW）和亲水性键合硅胶（如Zorbax GF 250和450）所取代。随所用填料的孔径大小不同，SEC能分离的分子量级分范围在1万到200万之间。对于分析分离或实验室小规模制备，平均粒度在3-13微米的规格较适用，有良好的柱效率和分离能力。但对大规模的制备分离和纯化，因要考虑成本和渗透性，可以采用较粗的粒度。HPSEC的负载量较低，分析型HPSEC负载量在10-500μg之间，体积负载为柱总体积的1-2%。

HPSEC除用于蛋白质分离外，还用在未知物分子量测定和纯度鉴定上。它比SDS-PAGE电泳测定速度快，而且对于由亚基组成的蛋白质，其测定值为天然分子量。也可以用于定量分析，误差小于5%。

（一）实验目的
检测nrhTNF
 

（二）仪器和试剂

1，高效液相色谱仪，Beckman Gold System系统

2，色谱柱：TSK-GEL G2000SW，日本曹达（TOSOH） 7.5×300mm

3，0.1mol/L PB-0.1mol/L NaCl pH6.8
 

（三）仪器参数

流动相  0.1mol/L PB-0.1mol/L NaCl pH6.8

检测波长  280nm

进样量  20μl

流速  0.5ml/min
 

（四）样品准备  
经Q-Sepharose FF和SP-Sepharose FF纯化的nrhTNF

（五）实验操作（示教）

1，缓冲液除气：可采用超声除气；微波除气；抽滤除气

2，开机

3，输入参数

4，平衡色谱柱

5，进样

6，洗脱

7，停止实验，打印和分析结果

8，洗柱和保存
 

（六）结果分析

1，保留时间

2，峰型及纯度（归一化法）

3，计算含量
 

附：TSK-GELSW系列凝胶过滤色谱柱资料。

尺寸排阻色谱（SEC,Size Exclusive Chromatography）是液相色谱的一个分支，其分离过程是根据被分析物质的分子体积（或分子量）大小，按顺序被洗脱出色谱柱，以达到复杂混合物的分离目的。尺寸排阻色谱是分析大分子化合物的重要手段之一，因为分子量和分子量的分布是化合物的最基本和最重要的参数。根据待分离样品的性质，尺寸排阻色谱又分为适合于分离水溶性样品的凝胶过滤色谱（GFC,Gel Filtration Chromatography）,以及适合于分离油溶性样品的凝胶渗透色谱（GPC,Gel Permeation Chromatography）。

TSK-FEL SW系列色谱柱的填料是以刚性的球型硅胶为基质，在其表面通过化学共价键键合上亲水化合物而成。TSK-GEL SW系列色谱柱的填料具有高性能尺寸排阻色谱所必需的性能，即低吸附性和良好的孔径分布；其pH适用范围为2.5-7.5，可以使用与水完全互溶的有机溶剂，如乙腈、丙酮、甲醇或乙醇等。TSK-GEL SW系列色谱柱适合用于分析分离蛋白质和多肽类样品，其他应用有大量的文献报道。最经常使用的是10μm的TSKgel 4000SW色谱柱；TSK-Gel2000SWXL和3000SWXL是5μm，TSK-Gel 4000SWXL是8μm的高效填料色谱柱；分析型色谱柱的结构可以是玻璃或不锈钢材质。