科学家开发新CRISPR系统——可调、可逆的一步式基因表达控制

　　生物通报道：控制基因表达水平的能力，是生物学中的一个主要任务。一种广泛使用的方法是删除一个感兴趣的非必须基因（Knockout），或者多步重组让一个感兴趣的基因表达减少（Knockdown）。然而，这些遗传学方法是费时费力的，并且对于定量研究来说是有限的。12月20日，在Nature子刊《Scientific Reports》发表的一项研究中，来自加州大学圣地亚哥分校的研究人员，报道了一种可调的CRISPR-cas系统——tCRISPRi，用于基因表达的精确和连续的滴定测量。

　　CRISPR-Cas是原核生物中RNA介导的一种免疫系统，它是由CRISPR和CRISPR相关蛋白Cas组成的。根据它们的进化关系主要有三种类型的CRISPR-Cas系统。在化脓性链球菌II型CRISPR-Cas系统中，大的单蛋白Cas9 具有RuvC样和HNH核酸内切酶结构域，负责靶DNA的切割以引起双链断裂。在HNH和RuvC样核酸酶结构域具有突变的核酸酶缺陷型Cas9（dcas9），不能切割DNA。相反，dCas9可紧密结合靶DNA，从而影响转录。dcas9可以瞬时或稳定地控制基因表达的水平，而不改变基因序列本身。最近开发的一种合成系统，可在体内减少RNA的加工步骤。Cas9的这些特性使其成为CRISPR介导的干扰 (CRISPRi) 的一种有力的工具。

　　同时，CRISPR Cas9用于基因组DNA编辑和基因调控的精度和通用性是强大的，许多CRISPR Cas9系统被Cas9的组成型表达引起的毒性所阻碍。原则上，这个问题可以通过在一个理想的可诱导和可调节的启动子下表达Cas9而得以解决。这将允许我们以一种剂量依赖性的模式，对Cas9的表达水平进行精确调控。不幸的是，许多常用的细菌诱导型启动子所起的作用是“开/关”开关，并缺乏一个变阻器样的功能来允许这种可调的基因表达。最近，有研究人员在一个木糖诱导型启动子下表达了dcas9，来敲除枯草芽孢杆菌中的必需基因，并基于功能分析表征了必需基因的网络结构。

　　将CRISPR -(d)Cas9系统用于高通量实验的另一个实际问题是，构建sgRNA用于靶定新基因的过程是费时费力的。目前用于sgRNA构建的方法主要依靠基于质粒的分子克隆技术，其次是转化。然而，质粒通常存在于多个副本中，因此当需要精确量化时它们就不太理想。质粒也含有自己的基因，并需要通过药物选择得以维持。因此，多拷贝质粒为基础的系统可能会抑制一般细胞的生长和基因表达，并且对细胞生理产生显著影响。

　　在这项研究中，研究人员开发了一种可调的CRISPRi (“tCRISPRi”)，它可以对大多数的必需和非必需基因实现30倍的抑制。研究人员还设计了细菌基因组，这样PBAD启动子就能够以一种剂量依赖性系统被阿拉伯糖诱导，而在缺乏阿拉伯糖的情况下没有表现出最小泄漏的双峰表达。根据外部添加的阿拉伯糖，dCas9的表达是以一种线性的方式进行回应。重要的是，这个品系只需要一个单链寡核苷酸重组步骤，就可以将想得到的sgRNA插入到染色体，以允许它的组成型表达。

　　这些结果表明，tCRISPRi与重组相结合，为基因表达的控制提供了一种简单和易于操作的工具，并且非常适合于单个sgRNA和高通量可调的knockdown文库的构建。