食品中对羟基苯甲酸酯类的检测—高效液相色谱法

　　摘要：文章采用超声提取-高效液相色谱法同时测定食品中3种对羟基苯甲酸酯（对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯）含量的方法。对羟基苯甲酸酯类属于防腐剂，按GB/T5009.31-2003国家推荐方法检测[1]，样品提取比较繁琐、费时，且回收效果欠佳。本文利用较为常见的紫外检测器通过优化条件，摸索出一个简捷、快速、经济、灵敏，又能保证一定精度的测定方法。本方法加标回收率在86.08%～112.71%之间，线性系数R>0.9998，检出限可达0.10ug/ml，分析时间短，完全能够满足分析要求，可广泛应用于食品中对羟基苯甲酸酯类检测分析。
　　1 实验部分
　　1.1 仪器和试剂
　　1.1.1 仪器 Shimadzu Lc 10vp plus高效液相色谱系统（日本Shimadzu公司），配紫外检测器及Lc solution色谱工作站；分析天平：感量0.1mg；氮吹仪：美国Organomation N-EVAP112型；均质机：IKAR werke T25型均质机；溶剂过滤装置；0.45μm和0.22μm过滤膜和过滤头；Milli-Q超纯水机。
　　1.1.2 试剂 甲醇、乙腈为HPLC级；乙醇为分析纯；水为超纯水。
　　标准品：对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯，纯度为99.0%，美国进口，购于上海安谱。
　　1.2 标准溶液的配制[2]
　　标准贮备液：精密称取三种标准物质0.05g，用无水乙醇溶解并定容于50mL容量瓶中，配制成浓度为1mg/mL的标准贮备液，贮于4℃冰箱中备用。
　　标准使用液：用刻度吸管准确吸取三种标准贮备液，根据需要用无水乙醇配制成不同浓度的标准溶液系列，待用。
　　1.3 色谱条件
　　色谱柱：Diamonsil C18，粒度5μm，4.6mm×250mm（ID×L）；检测波长：254nm；流速：1.0mL/min；进样量：20 μL；流动相：水-乙腈（体积比为45：55）；柱温：室温。
　　1.4 实验方法
　　1.4.1 样品准备和处理 称取样品5g（精确至0.01g），置于50mL比色管中，加入25mL无水乙醇，置超声波水浴中提取10min，取出，4000rpm离心10min，上清液转入容量瓶中，残留物再用25mL无水乙醇重复提取1次，合并上清液，用无水乙醇定容至50.0mL，静止，上清液经微孔滤膜（4.5μm）过滤作为试液，供高效液相色谱仪测定。
　　1.4.2 样品分析 在相同色谱条件下，将标准工作液按照浓度由低到高的顺序进样测定，以各组分的峰面积对其浓度绘制标准曲线。待测液在于标准曲线进样相同的条件下进样分析，以保留时间定性，峰面积外标法定量。
　　2 结果与讨论[3]
　　2.1 提取溶剂的确定
　　对羟基苯甲酸酯类难溶于水，易溶于甲醇、乙醇等有机溶剂。分别选用乙醇、甲醇作为提取溶剂进行回收率试验。试验结果表明，甲醇和乙醇均具有较高的提取效率，无明显差异。由于甲醇挥发后易被呼吸道、胃肠道和皮肤吸收而致中毒，对长期接触的实验人员具有一定的伤害，而乙醇毒性较小，因此本试验中采用乙醇作为提取溶剂。
　　2.2 流动相的选择
　　为选择最佳的流动相，分别用乙腈-水、甲醇-水和甲醇-乙酸铵溶液三种流动相体系进行了试验。由于此仪器为单泵系统，无法采用梯度而只能采用等度的流动相配比。结果显示，使用甲醇-水流动相的分离度不是很好；甲醇-乙酸铵溶液分离较好，但由于溶液中含有盐类，用久了会对柱子寿命有一定影响；乙腈-水流动相体系，分离度较好，且配制简单，对柱子无不良影响。此外，还考察了不同体积分数的乙腈-水对各组分分离的影响。结果显示，乙醇体积分数为55%时流动相最为适合，分离效果好，色谱峰明显，而且保留时间合适。
　　2.3 检测波长的选择
　　用紫外检测器分别在254、248nm波长处对各组分的标准溶液进行检测，发现3种组分在254nm处紫外吸收较强，灵敏度较高，因此本实验优先选择254nm作为该实验的检测波长。
　　2.4 方法的评价
　　对羟基苯甲酸酯类的混合标准工作液均用乙醇稀释并定容，三种对羟基苯甲酸酯类标准溶液浓度系列为0.008mg/L、0.04mg/L、0.4mg/L和4.0mg/L。对羟基苯甲酸酯类标准品通过高效液相色谱进行分析，检测结果如图1所示。实验结果表明，在乙腈-水（55：45）为流动相条件下，各组分保留时间合适，而且分离效果较好。图1为三种对羟基苯甲酸酯类四种标准系列的标准品的高效液相色谱图。
　　图1 三种对羟基苯甲酸酯类四种浓度标准品的高效液相色谱图
　　峰1.对羟基苯甲酸甲酯（尼泊金甲酯）；峰2.对羟基苯甲酸乙酯（尼泊金乙酯）
　　峰3.对羟基苯甲酸丙酯（尼泊金丙酯）
　　表1为三种对羟基苯甲酸酯类不同浓度进样时保留时间的变化及峰面积变化表，保留时间的RSD%分别为0.260、0.241、0.204。
　　图2为三种对羟基苯甲酸酯类浓度为0.008mg/L时进样时的出峰状况。峰形明显，可以作为判定依据。
　　2.5 加标回收率
　　向5份样品中分别加入不同量的对羟基苯甲酸甲酯标准溶液，按本法处理、测定并计算回收率，结果见表2。
　　2.6 检出限
　　本方法检出限0.10μg/mL。
　　2.7 优点
　　样品前处理简单，省时省力；液相分析也无需使用梯度，等度淋洗即可，对液相系统没有严格要求，一般单位均能承受。
　　3 结论
　　实验表明，本方法所用乙腈-水流动相，对分析柱的损害较小；样品加标回收率在86.00%～109.50%之间；线性系数R>0.9998；三种对羟基苯甲酸酯类检出限均可达到0.10μg/mL，能够满足一般食品等样品中对羟基苯甲酸酯类残留量的分析要求。另外本方法具有简便快速、准确灵敏、成本低、可靠性强等优点，应用前景广泛。
　　通讯作者：修丽华，女，长春市产品质量监督检验院正高级工程师，从事食品检测技术研究和新方法开发工作。