2. （可选步骤） 肿瘤抗原的制备
用于负载 DC 的肿瘤抗原可以是肿瘤特异性抗原肽 （Tumor-Specific Antigens, TSA）或肿瘤相关抗原 （Tumor-αssociated Antigens, TAA），也可以是肿瘤全细胞抗原。
用
TSA 或 TAA 负载的 DC 具有很好的靶向性，但该方法具有已确定的肿瘤特异性
抗原或抗原肽种类少和单一抗原的免疫攻击经常无法杀伤肿瘤细胞等缺陷。而用肿瘤全 细胞抗原负载 DC
可克服这些缺陷，因为此时无需知道那些抗原是肿瘤细胞的 TSA 或 TAA,而且全抗原中的多种不同肿瘤抗原冲击 DC
可诱导产生针对不同抗原决定簇的细 胞毒 T 淋巴细胞 （CTL） 克隆，从而实现对肿瘤细胞的有效杀伤。
肿瘤细胞全抗原负载
DC 的方法很多，包括用肿瘤细胞裂解液负载 DC、用凋亡肿 瘤细胞负载 DC、用坏死或死亡的肿瘤细胞负载 DC,用肿瘤活细胞负载
DC,和将肿瘤 细胞与 DC 融合等。目前临床上常用的是用肿瘤细胞裂解液负载 DC,因该方法简单、 快速、有效。
反复冻融是获得肿瘤细胞裂解液的常见方法，具体步骤如下：
2.1手术切除肿瘤标本，无菌条件下，将坏死组织和癌旁非肿瘤组织去除干净；
2.2无菌生理盐水洗 3 次；
2.3用无菌的组织剪将肿瘤组织剪碎，加入 RPMI 1640 培养基，充分研磨；
2.4200 目无菌网过滤后收集单细胞悬液；
2.5用 RPMI 1640 培养基重悬细胞至 1-2 x 107/ml,装入 5 ml 无菌冻存管中；
2.6将冻存管浸入液氮中速冻，10 min 后取出，再迅速放入 37oC 水浴中解冻 10 min。反复 3-5 次；注：也可以-80oC/37oC 反复冻融 3-5 次。
2.7 将肿瘤裂解物加入离心管中，3000rpm,离心 10 min；
2.8收取上清，0.22mm 滤膜过滤除菌，留样检测蛋白含量及细菌、真菌和支原体；2.9-80oC 保存备用。
3. CIK 细胞的培养及鉴定
3.1 步骤 1 中获得的 PBMC 用无血清培养液调整细胞浓度至 2 x 106/ml,置于培养瓶内；
3.2 37℃，5%CO2 培养箱中孵育 2 h,以使单核细胞贴壁。
3.3 收集悬浮细胞，用无血清培养液调整细胞浓度至 1-2 x 106/ml。
3.4 加入 1,000 U/ml 的重组人 IFN-γ 培养；
3.5 24 h 后加入 50ng/ml 的 CD3 单克隆抗体和 300 U/ml 的重组人 IL-2,刺激 CIK 细 胞的生长和增殖；注：此时也可同时加入 100 U/ml 的重组人 IL-1α.
3.6 每 3 天半量换液或扩瓶一次，并补加重组人 IL-2 300 U/ml；
3.7在培养的第 7d,收获 CIK 细胞，此时数量应达到 1x 109 个以上。
3.8 CIK 细胞质控：
3.8.1 台盼蓝染色检测细胞活力：活细胞应在 80% 以上；3.8.2 用流式细胞仪检测细胞表面 CD3、CD8 和 CD56 等分子的表达 ,观察CD3+CD56+细胞的比例是否明显提高。