DNA的PCR扩增及Southemblot分析

    DNA存在于细胞核和线粒体内．携带遗传信息，决定着细胞和个体的遗传性状。细胞DNA的检测有助于了解DNA的特征，如复制、表达以及变异情况等，从而在分子水平研究细胞的生物学特征，细胞的DNA检测主要包括DNA的提取及检测。检测方法有多种，如PCR、限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism；RFLP)、基因芯片、原位杂交等。

一、DNA的提取

(一)原理

    真核生物的一切有核细胞(包括培养细胞)都能用来制备基因组DNA。真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内，因此，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS(十二烷基硫酸钠)和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿／异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。

    蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA(乙二胺四乙酸二钠)存在下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离，EDTA则抑制细胞中DNase的活性；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸．使DNA分子完整地分离出来。

(二)材料

1．组织或培养细胞。

2．试剂

(1)细胞裂解缓冲液：Tris(pH8．O)10O mmol／L、EDTA(pH 8．0)500 mmol／L、NaCl 20 mmol／L、SDS 10％、胰RNA酶20μg／ml。

(2)蛋白酶K：称取20mg蛋白酶K溶于1ml灭菌的双蒸水中，一20℃备用。

(3)TE缓冲液(pH 8．0)：高压灭菌，室温贮存。

(4)酚／氯仿／异戊醇(25：24：1)。

(5)异丙醇、冷无水乙醇、70％乙醇、灭菌水。

3．器具恒温水浴锅、台式离心机、紫外分光光度计、移液器、玻璃匀浆器、离心管(灭菌)、吸头(灭菌)。

(三)方法

1．取培养细胞沉淀约107个置于1．5ml离心管中，加入蛋白酶K(500μg／ml)20μl，混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴，30min．也可转入37℃水浴12～24h，间歇振荡离心管数次。于台式离心机以12000r／min离心5min，取上清液入另一离心管中。

2．加2倍体积异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物，用lOOμl吸头挑出，晾干，用200μl TE重新溶解(可进行PCR反应等，需要进一步纯化的按下列步骤进行)。

3．加等量的酚／氯仿／异戊醇振荡混匀，离心12000r／min，5min。

4．取上层溶液至另一管，加入等体积的氯仿／异戊醇，振荡混匀，离心12000r/min，5min。

5．取上层溶液至另一管，加入1／2体积的7．5mol／L乙酸氨加入2倍体积的无水乙醇．混匀后室温沉淀2min，离心1200 r／min，10min。

6．小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。

7．用lml 70％乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000 r／min 5min。

8．小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。

9．加200μl TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或一20℃保存备用。

10．吸取适量样品于分光光度计上检测浓度和纯度。

(四)注意事项

1.选择的实验材料要新鲜，处理时间不宜过长。

2．在加入细胞裂解缓冲液前，细胞必须均匀分散，以减少DNA团块形成。

3．提取的DNA不易溶解：不纯，含杂质较多；加溶解液太少使浓度过大。沉淀物太干燥，也将使溶解变得很困难。

4．电泳检测时DNA成涂布状：操作不慎；污染核酸酶等。

5．分光光度分析DNA的A280／A260小于1．8；不纯，含有蛋白质等杂质。在这种情况下，应加入SDS至终浓度为0．5％，并重复步骤2～8。

6．酚／氯仿／异戊醇抽提后，其上清液太黏不易吸取：含高浓度的DNA，可加大抽提前缓冲液的量或减少所取组织的量。