实验概要
免疫组织化学 (IHC) 是确定组织切片上是否存在蛋白及其位置的一种方法。尽管这种方法在定量分析时灵敏度较免疫印迹法或 ELISA 等免疫测定方法低，但它能了解整个组织的情况。适用于癌症等疾病发展及治疗情况的评估。因此，从 IHC 获得的信 息结合显微技术提供了一副“宏图”，使来自其它方法的数据有据可依。
免疫组织化学染色是抗体识别目标抗原的过程。抗体具有高度特异性，只与组织切片上相应的蛋白抗原结合。应用显色检测法即能显示抗原-抗体反应，一种显色方法是酶结合抗体作为底物，在蛋白抗原位点产生色素沉着，另一种方法是荧光检测法，即 将荧光染料结合到抗体上，应用荧光显微技术检测。
实验步骤
1. 固定
正确的固定是免疫组织化学法的关键。最常用的是 10% 中性甲醛溶液 (NBF)。Abcam 说明书推荐 IHC-P 使用该固定剂，另有说明的除外。
其它不常用的固定剂还有多聚甲醛 (PFA) 或 Bouin's 液（甲醛/苦味酸）等。
理想的固定时间取决于组织切块的大小和类型。对于大多数组织来说，通常固定时间在 18-24 小时之间较为理想。固定不足可能导致组织切片边缘有染色信号强，中间无信号。固定过度将会屏蔽抗原表位。虽然抗原修复有助于克服屏蔽作用，但如果固定时间太长（比如一周）那么抗原修复也无济于事。
固定后，将组织块包埋于石蜡中，用切片机切成理想厚度（依据组织一般大约在 5-20 微米）的切片，然后将切片附着在玻片上。组织切片最好封固在正电荷吸附或 3-氨基-丙酯-三-乙氧基-硅烷 (APES) 包被的玻片上，室温过夜，脱水并彻底干燥。如果切片不能很好的附着在玻片上，可以将其与玻片共同置于 60 °C 孵育数小时。
2. 脱蜡
将切片置于架子上，依据下列方法依次冲洗：
1) 二甲苯：2 X 3 分钟
2) 二甲苯与无水乙醇 1:1 混匀：3 分钟
3) 无水乙醇：2 X 3 分钟
4) 95% 乙醇：3 分钟
5) 70 %乙醇：3 分钟
6) 50 % 乙醇：3 分钟
7) 冷水流洗
3. 抗原修复
1) 将合适的抗原修复缓冲液加入高压锅内，然后将锅置于加热板并开至最大功率，此时不要把盖子盖紧。在等待煮沸过程中，按上所述对切片脱蜡至水。
2) 煮沸后，将玻片从自来水中移到高压锅内。小心热溶液-使用镊子。依照说明书加上加压阀。
3) 高压锅达到最大压力后（见用户说明书），维持 3 分钟（见注意事项 1）。
4) 3 分钟后，关掉加热板，取下高压锅。
5) 打开高压锅阀门（见用户说明书），冷水冷却锅身。压力降下后，打开锅盖，冷水冷却 10 分钟。小心热溶液（见注意事项 2）。
6) 参照免疫组织化学染色说明书继续染色。
4. 免疫组织化学染色
1) 操作方法
a. 若使用 HRP 标记二抗检测，则需要封闭内源性过氧化物酶，但我们建议在开始一抗孵育前不予理会。
b. 在含 0.025% Triton X-100 的 TBS 中漂洗玻片 2×5 分钟 ，轻轻震荡。
c. 用含 10% 正常血清、1% BSA 的 TBS 室温封闭 2 小时。控干封闭液（不是漂洗），并用纸巾将玻片周围擦干。
d. 一抗用含 1% BSA 的 TBS 稀释后加到玻片上。
e. 4 °C 孵育过夜。
f. 用含 0.025% Triton X-100 的 TBS 漂洗 2 X 5 分钟，并轻轻震荡。
g. 若使用 HRP 标记二抗检测，则需将玻片在含 0.3% H2O2 的 TBS 中孵育 15 分钟以封闭内源性过氧化物酶。
h. 酶法检测（HRP 或 AP 标记二抗）：
i. 在 TBS 中漂洗 3 X 5 分钟。
j. 若采用荧光检测，则结束此步后就可以用封固剂和盖玻片进行封固了。
k. 若采用底物显色，则还需继续进行下述操作。
l. 室温下与底物作用 10 分钟。
m. 流水冲洗 5 分钟。
n. 复染（如果需要）。
o. 脱水，擦干并封固。
2) 对照
为了评价非特异性交叉反应和 Fc 受体结合的影响，与一抗同型但不相关的抗体（如 BrdU）将用来做对照。与不相关抗原结合的抗体称为同型对照。对于全血清抗体而言，对照抗体是来源于同种动物的未免疫正常血清。
如果没有同型对照，可用阴性对照代替，即以抗体稀释液代替一抗。强力推荐阳性组织对照，确保抗体达到预期效果。根据实验需要，也可设阴性组织对照，在该组织中应没有目标蛋白存在的。
3) 信号放大
为得到较强的信号，可采用多种策略将更多的酶或荧光染料结合到目标蛋白上。
a. 卵白素-生物素 (ABC)
该技术是由 Su-Ming Hsu 及其同事 (J Histochem Cytochem. 1981 Apr 29 (4):577-80) 共同建立的。卵白素是在鸡蛋清中发现的，与生物素有高亲和力，有 4 个生物素结合位点，并且这种结合是不可逆的。生物素是羧基化反应中酶的辅助因子。
简言之，先将一抗结合到目标蛋白上，再将生物素标记二抗结合到一抗上。另一反应系统中，将卵白素与生物素化的酶按一定比例混合形成卵白素-生物素-酶复合物，并且使卵白素上保留一定的未结合位点。切片与抗体孵育后，再与此复合物共同孵育，使复合物卵白素上未结合位点与生物素化的二抗结合，相比较酶标二抗或一抗而言可以使更多的酶接触底物。
卵白素-生物素复合物有市售试剂盒，提供有两种试剂及结合最佳比例的说明。该复合物适用于 Abcam 推荐的所有生物素化抗体。注意有些组织中存在的内源性生物素，如肾脏、肝脏、大脑、前列腺、结肠、肠、睾丸等会与卵白素-生物素复合物结合导致背景染色 (Wang and Pevsner, Cell Tissue Res. 1999 Jun;296(3):511-6.).
b. 标记的链霉生物素 (LSAB)
该方法同 ABC 法相似，它利用了链霉亲和素（亲和力与生物素相似）和生物素之间的相互作用。一抗与生物素标记的抗 Ig 二抗结合后，再与结合在酶或荧光染料上的链酶亲和素结合。Abcam 提供有链霉亲和素-HRP 结合物，ab7403。
应用链霉亲和素代替卵白素可以使非特异性背景染色更少，因为链霉亲和素是非糖基化的（卵白素不是），不会与凝集素或其它糖结合蛋白反应。文献报道 LSAB 法比 ABC 法灵敏 4-8 倍，详见 Giorno R, Diagno Immunol.1984;2(3):161-6。
c. HRP 聚合物
将二抗与聚合物-酶复合物结合形成的新型聚合物-酶-抗体产物（如抗鼠和/或兔 IgG）优于上述两种卵白素-生物素法（ABC 和 LSAB）。因为此种方法比上述两种方法减少一步，并且避免了组织内源性生物素的干扰。Abcam 提供有羊抗兔/鼠 IgG HRP 多聚物，ab2891。