MRM3定量分析人血浆中的依克那肽

图1.MRM3定量分析的原理图示。母离子在Q1中选择，然后在Q2碰撞池中碎裂，产生的子离子被离子阱富集和分离，并被激发产生二级碎裂，所产生的二级碎裂子离子被扫描出离子阱并被检测器检测。

目前，串联质谱（MS/MS或MS2）技术能够降低干扰，大幅度地提高选择性，从而提供了极低的基线、极优的定量限和良好的线性，使得其取代了单极质谱和其它非质量选择方法，成为液相色谱定量分析中应用广泛的一种检测技术。但在某些情况下，MRM方式并不能消除干扰，此时，增加一个第三级质谱（MS/MS/MS）将显著增加选择性，降低基线或消除色谱干扰，从而获得更低的定量限和更好的分析结果。

串联质谱（MS/MS或MS2）技术能够降低干扰，大幅度地提高选择性，从而提供了极低的基线、极优的定量限和良好的线性，使得其取代了单极质谱和其它非质量选择方法，成为液相色谱定量分析中应用广泛的一种检测技术。基于多反应监测方式（MRM）的三重四极杆质谱仪与液相色谱联用（LC-MS）技术已成为生物基质中高灵敏度和高选择性定量分析的首选。

在某些情况下，MRM方式并不能消除干扰，这就需要由复杂的样品预处理和色谱分离过程来实现，从而大大延长了分析所需的时间和复杂程度。在一些较为极端的情况下，高的基线背景和基质干扰甚至无法通过上述方式来避免，这将导致较差的定量限，较低的分析准确度和精密度。此时，增加一个第三级质谱（MS/MS/MS）将显著增加选择性，降低基线或消除色谱干扰，从而获得更低的定量限和更好的分析结果。

图2.EMS扫描用于选择主要的母离子（A），EPI扫描用于选择丰度最高的子离子（B）， MS3扫描用于选择最强的二级子离子。

实现灵敏的液相色谱联用三级质谱（LC-MS/MS, MRM3）分析对质谱仪本身提出了极高的要求，这需要仪器具备如下三个主要性能特点：具备三级质谱功能，具备可以抵消因多重碎裂步骤而致的离子流损失的超高灵敏度，具备与快速液相色谱峰匹配的扫描速度。AB SCIEX QTRAP 5500 串联三重四级杆复合线性离子阱质谱仪为建立LC-MS MRM3方法提供了完美的硬件支持。

QTRAP 5500 的MRM3技术

MRM3定量：在QTRAP 5500质谱系统上，MS3扫描由快速循环实现，以第二级产物离子为中心，设定窄扫描范围，用某个二级产物离子的提取离子流色谱图或者几个二级产物离子的总离子流色谱图进行定量。这种类型的定量方式被称为MRM3定量（图1）。

更快的线性离子阱扫描速度：QTRAP 5500质谱系统的线性离子阱扫描速度最高可达20?000 Da/sec，保证了MS3扫描的循环时间与液相色谱出峰时间相匹配，即色谱峰上有足够的数据点数可供第二级产物离子的提取离子色谱图（XICs）选取和积分。

更好的阱内裂解：QTRAP 5500质谱系统具有带脉冲气阀的新型线性加速离子阱，可提供更快速高效的阱内裂解。

图3.A为使用MRM定量时的色谱图，B为使用MRM3定量时的色谱图，进样量均为5ng/ml。

最高灵敏度的离子阱：QTRAP 5500质谱系统采用了最高灵敏度的商用离子阱质量分析器。

高选择性：母离子在Q1以单位分辨率分离，之后在离子阱以单位分辨率分离激发和裂解，可以提供高选择性的MRM3分析。

MRM3定量分析人血浆中的依克那肽

依克那肽（Exenatide）是一个包含39个氨基酸残基的肽（分子量为4186.6 Da），已被批准用于治疗1型和2型糖尿病。该肽可以增强胰腺细胞的葡萄糖依赖性胰岛素的分泌，从而调控葡萄糖的代谢。在过去的几年里，血浆中依克那肽的定量分析通常是用配体-结合法来完成的。例如，药物动力学研究中，常用酶免疫分析法定量依克那肽，但当基质中含有与待测物具有类似物理化学性质的干扰物时，该方法有时存在选择性不够的问题。QTRAP 5500 质谱系统MRM3定量技术可保证人血浆中依克那肽测定的高选择性，本文对此进行了研究。

实验方法

样品制备：依克那肽从血浆中提出，提取液用氮气挥干，复溶。在所有的制备步骤中，溶液的pH值和有机相浓度须精确控制。

液相色谱：Shimadzu UFLC LC-20ACXR；反相色谱柱C-18 2.0×30 mm, 5μm；流速 0.6 ml/min；流动相A 为0.1% 甲酸水溶液；流动相B为0.1% 甲酸甲醇溶液；梯度洗脱，5min内，流动相B从2%增至95%；进样量5μl。

图4.A为MRM定量法的标准曲线，线性范围为250~1000ng/ml；B为MRM3定量法的标准曲线，线性范围为5~2000 ng/ml，并有更好的线性（r=0.996）。

质谱：使用AB SCIEX QTRAP 5500 质谱系统，MRM3扫描方式。在MRM3扫描中，离子阱填充时间设定为动态填充时间（DFT），扫描速度10?000 Da/Sec，离子阱激发时间为25 ms，每个质谱扫描循环时长0.17s。MRM3扫描的三级离子为838-396-202。

方法建立

在增强一级质谱全扫描（EMS）模式下，依克那肽产生带5个正电荷的离子，m/z 838.3（图2A），该离子被选为母离子。该离子在增强子离子（EPI）扫描模式下碎裂，产生的主要子离子为m/z 396.4（图2B）。该一级子离子在线性离子阱中发生碎裂，产生MS3谱图，其主要子离子为m/z 202.2（图2C）。上述三个离子被用来构建LC-MS MRM3定量方法。

结果和讨论

使用LC-MS MRM3分析血浆提取物中的依克那肽可以明显地提高选择性。图3给出了MRM3分析和传统MRM分析所获得色谱图的比较，可以看出，MRM3色谱图中基线较低，且没有MRM色谱图中的干扰峰。QTRAP 5500的快扫描速度（10000 Da/Sec）保证了有足够的数据点来获得离子色谱峰，从而使得定量具有良好的重现性和准确度。

从表1可以看出，本方法良好的重现性能使得其在最低定量限（LLOQ）以及4个浓度水平的质量控制样本上都表现出了良好的定量结果。6样本重复进样的准确度和精密度结果表明MRM3法进行定量分析能够满足生物样本分析方法确证的要求。

总结

本文采用QTRAP 5500 串联三重四级杆复合线性离子阱质谱仪的MS3技术成功地建立了一种用于人血浆中依克那肽（Exenatide）定量分析的LC-MS MRM3方法。与传统的MRM方法相比，MRM3具备更强的选择性，可以很好地降低基线噪音和杂质色谱峰干扰，从而表现出更好的定量分析性能。在本实验中，使用MRM3分析的线性范围可达5~2000 ng/ml，而使用传统的MRM仅为250~1000 ng/ml。本分析方法的准确度和精密度完全满足生物分析方法确证的要求。