NatureGenetics：全基因组测序领域的开拓性进展

　　当我们提到DNA的甲基化，通常是指胞嘧啶(C)碳环上5号碳原子的甲基化，5-甲基胞嘧啶(5mC)。实际上，在原核生物中存在着3种DNA甲基化型式，5mC、4mC（4-甲基胞嘧啶）和6mA（6-甲基腺嘌呤），6mA起主导作用，缺乏6mA可导致一些细菌的死亡。科学家们曾经以为具有重要生理功能的DNA 6mA修饰在生命的进化过程中，不可思议地从高等生物基因组中消失了。Nature重大发现改写表观遗传理论

　　为了检验真核生物基因组中是否存在DNA 6mA修饰，更高灵敏度的检测方法和设备应运而出。然而，由于检测技术手段限制，科学界在低等单细胞真核生物、植物和动物基因组内检测到低水平的6mA后，便猜测它可能是一个非典型的DNA碱基修饰型式。虽然有报道指出，与5mC的基因抑制作用不同，6mA似乎能启动某些基因的激活。但总的来说，有关6mA与真核生物基因组功能的研究基本还是一片空白。如今，高灵敏度的单分子实时测序（Single-Molecule Sequencing in Real Time，SMRT）技术不仅为科研人员提供了高质量的基因组组装，同时还能精准地谱写表观遗传学图谱。5月8日《Nature Genetics》刊登了一篇有关SMRT技术在6mA表观遗传学功能分析方面的最新进展。

　　大部分已被人类研究过的真菌只属于两个门：子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）。其他6个种群被归类为“早期分化系（early diverging lineages）”，它们是真菌家族里最早的分支，探索这些原始真菌的基因产物对人类来说极有价值。真菌可以降解几乎所有的天然聚合物，甚至一些人为化工产品，美国能源部门的任务之一便是从真菌中开发生物能源和环保资源。

　　“总的来说，与其他真菌成员相比，人们对早期分化系的了解相对贫乏。但是人们逐渐发现，这些品种却有着丰富的重要用途。”本文的一作DOE JGI分析师Stephen Mondo说。“例如Neocallimastigomycetes，它是目前已知的具有最强降解能力的真菌，它拥有着如军火库般的植物细胞壁降解酶系统，这项能力可被用于生物能源的生产。”

　　美国能源合作基因组研究部（DOE JGI）的大规模的测序结果显示，6mA修饰普遍存在于早期真菌种属。研究人员采用PacBio单分子长片段测序平台（型号：PacBio SMRT Analysis 2.3.0）对16种不同真菌进行基因组测序时，观察到在早期分化的真菌基因组中，高达2.8％的腺嘌呤发生了甲基化，远高于有报道的其他真核生物的6mA比例（此前6mA修饰记录的保持者是一种水藻，仅有0.4%的腺嘌呤含有甲基化标签）。

　　之前的研究发现真菌5mC一般对称地出现在反义DNA链的回文CpG岛（胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸密集区域）。本研究发现，早期分化系真菌的6mA是以对称的方式，出现在ApT（腺嘌呤-胸腺嘧啶）富集区。6mA在两股DNA链上保持同步出现，可能是为了细胞分裂中的甲基化传递。

　　在双核菌亚界真菌的基因组中并未发现6mA的这种分布规律，而是散乱的非簇排列。相反，早期分化系真菌的6mA标记有80-99.6%都出现在 “甲基腺嘌呤集群(methylated adenine clusters, MACs)”。

　　研究团队发现，5mC和6mA还存在着负相关性。具体来说，当5mC出现在基因组的重复区域时，MACs便会出现在启动子上。这暗示了作为真核生物中基因表达相关的表观遗传标记，6mA可能具有独特的作用。

　　“这次的研究是我们首次在真核生物基因组内直接对5mC和6mA进行比较分析，并且也是首个真菌6mA分析研究，”本文通讯作者、DOE JGI真菌基因组研究学术带头人Igor Grigoriev说。“在有机体内6mA的功能十分多样，在动物中它参与转座子活性的抑制作用，在藻类中它促进基因的表达。我们的分析表明，6mA与基因表达相关，并且甲基标签根据基因功能选择性地沉淀于功能和节能相关的基因上，这表示6mA是重要功能相关基因的生物标签。”

　　“根据基因组学数据，我们列出了具有多样化开发潜力的基因、酶和基于生物经济和生物能源应用的代谢途径目录，”Grigoriev说。“大量的有用编码基因中，绝大多数基因都含有6mA MACs。这项发现将有助于科研界更好地了解经济价值基因的调控方式。”

　　“1000个真菌基因组”项目的目标是：每科真菌中，至少获得1个代表种的参考全基因组序列。这篇《Nature Genetics》文章中的许多基因组都隶属于1000个真菌基因组项目。使用Pacific Biosciences测序平台，研究小组高质地完成了基因组组装，并利用该测序平台额外挖掘了真菌的表观遗传学修饰后，研究人员还使用免疫沉淀法（ChIP-seq和6mA IP-seq）和质谱分析法（LC-MS）等方法对比验证了SMRT-seq的新发现。

　　早期分支系真菌的表观遗传学检测结果显示，Illumina二代测序技术和质谱技术都与SMRT-seq达成一致。但是在6种双核菌亚界真菌中，尽管这些基因组内的6mA含量本身较低，SMRT-seq的检出率仍高于其他测序方法。原因有二，或是其他技术的灵敏度低于SMRT-seq，或是SMRT-seq技术的假阳性偏高。考虑到其他10种基因组测序结果的一致性，我们有理由相信，减少了PCR扩增环节，逐个分子的覆盖式扫描将带给我们更高广的视野。