RNA原位杂交实验

实验方法原理 原位杂交的原理是含有互补序列（探针）的被标记的单链 DNA 或 RNA 片段在适当 的条件下与细胞的 DNA 或 RNA 杂交形成稳定的杂交体。无论是 DNA( dsDNA、寡核苷酸和 ssDNA ) 或是 RNA( SSC RNA) 探针均能用于定位 DNA 和 mRNA，并且均能用于两 个主要类型的标记策略：直接标记，即用报道分子（如同位素）附着于 DNA 或 RNA；间接标记，在该法中将半抗原（如生物素或地高辛）附着于探针上，然后用标记的结合蛋白 (如亲合素）检测或者用特异性的抗体检测靶探针杂交体。这些基本步骤是相互依赖的，为了得到最佳结果，前面步骤中的任何一个变化均要求以后的步骤作出相应的变化。事实上 对于许多组织化学的步骤来说，一个给定系统的“理想方法”肯定是靠大量实践检验建立起来的。

实验材料 线状 DNA 模板DNaseⅠ抗荧光素-碱性磷酸醋酶结合物

试剂、试剂盒 转录缓冲液人胎盘核糖核酸酶抑制剂DTT核苷酸溶液冰乙酸NaHCO3乙酸钠酵母 tRNA杂交缓冲液SSC储存液封闭缓冲液检测缓冲液NBT溶液 BCIP溶液

实验步骤

一、材料与设备

1. 转录缓冲液：200 mmol/I Tris-HCl ( pH 7.5 )，30 mmol/L MgCl2，10 mmol/L 亚精胺，0.5%（m/V）BSA。

2. 人胎盘核糖核酸酶抑制剂（human placental ribonuclease inhibitor, HPRT) : 20 U/μl。

3. 2 mmol/L DTT : 新鲜配制，过滤除菌。

4. 线状 DNA 模板：通常 0.5~1 μg/μl。

5. SP6，T7 或 T3RNA 聚合酶。

6. 核苷酸溶液：1.25 mmol/L ATP、1.25 mmol/L GTP、1.25 mmol/L CTP、0.312 mmol/L UTP、0. 312 mmol/L 荧光素-11-UTP 溶于灭菌水。

7. 无 RNase 的 DNaseⅠ：用灭菌水新鲜配制，稀释至 10 U/ 80 μl。

8. 4 mol/L NaHCO3，高压灭菌。

9. 6 mol/L NaHCO3，高压灭菌。

10. 冰乙酸。

11. 3 mol/L 乙酸钠（pH 5.2）高压灭菌。

12. 10 mg/ml 酵母 tRNA。

13. 杂交缓冲液：可用标准杂交缓冲液。这里推荐一种优化缓冲液成品，可从 Amersham 公句购得。缓冲液由以下成分组成： 4XSSC，600 μg/ml 鲑鱼精 DNA，2X Denhardt 溶液。此杂交缓冲液还含有一种用于提高杂交效率的ZL化合物。在使用前，这一缓冲液需用去离子甲酰胺按 1：1 稀释，稀释后的溶液可储存于 -20℃。

14. 20X SSC 储存液：3 mol/L NaCl，0.3mol/L 柠檬酸钠（pH7.0 )。

15. 10% (m/V) SDS。

16. TBS：100 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5 )，400 mmoI/L NaCl。

17. 封闭缓冲液：0.5%（m/V）封闭剂（RPN3023、Amersham International），溶于 TBS。

18. 抗荧光素-碱性磷酸醋酶结合物：可从 Amersham 公司购得。

19. 检测缓冲液：100 mmol/L Tris-HCl ( pH 9.5)，100 mmol/L NaCl，10 mmol/L MgCl2。

20. NBT 溶液：50 mg/ml 硝基蓝四唑（niroblue tetrazolium，NBT）溶于二甲基甲酰胺。

21. BCIP 溶液：75 mg/ml 溴-氯-吲哚磷酸（bromo-chloro-indolyl phosphate，BCIP ) 溶于 70% ( V/V ) 二甲基甲酰胺。

二、操作方法

1. 探针标记

(1) 室温下于 1.5 ml 微量离心管中依次加入下列试剂：转录缓冲液 4 μl，0.2 mg/L DTT 1 μl，HPRI 20 U，核苷酸溶液 8 μl，线状 DNA 模板 1 μg，RNA 聚合酶 25 U，加水至终体积为 20 μl，轻轻混匀。

(2) 至少保温 2 h。不同的 RNA 聚合酶的保温温度不同，SP6 为 40℃，T3 和 T7 均为 37℃。

(3) 标记的 RNA 探针可储存于 -20℃。

2. 标记探针的纯化及加工

(1) 于 RNA 探针混合液中加入 10 U 无 RNase 的 DNase Ⅰ，37℃ 保温 10 min。

(2) 加入 20 μl 0.4 mol/L NaHCO3，20 μl 0.6mol/L Na2CO3，60 μl 灭菌水。轻轻混匀，于 60℃ 保温进行碱水解。保温时间依转录物的长度及所需探针的大小而定。

(3) 加入 1.3 μl 冰乙酸，20 μl 3 mol/L 乙酸钠（pH 5.2 )，2 μl 10 mg/ml 酵母 tRNA，500 μl 乙醇，于 -20℃ 至少放置 2 h 以沉淀 RNA。

(4) 于微型离心机上用最高速度离心 15 min 沉淀 RNA，弃上清液。

(5) 用 70% 乙醇淋洗沉淀，保持 -20℃：离心 5 min，弃上清液。

(6) 用灭菌水溶解 RNA 探针，并调整 RNA 探针浓度为杂交所需浓度的 10~20 倍，于 -20℃ 保存。

3. 组织及细胞的预处理

用于原位杂交的所有组织可用中性缓冲的甲醛（4%) 固定，醛固定剂能很好的保留细胞 RNA，甲醛灌注动物或刚冰冻的组织切片应固定于室温下的甲醛中，未灌流的组织比灌流的组织更易于进行冰冻切片，更易于附着于载玻片上。

(1) 灌流的组织。

用普通盐水灌流动物以去除血红细胞，接着用约 200 ml 溶于 0.1 mol/L PBS 中的 4% 甲醛溶液灌洗动物，置于 20% 蔗糖 (溶于 PBS) 溶液中过夜。将组织冰冻于液氮中并储存于 -80℃。

在约 -20°C 将组织进行切片（10 μm 或更薄 ) 并将切片转移至经聚赖氨酸处理的载玻片上。于 -80℃ 储存组织切片。

(2) 未灌流的组织。

将新鲜组织冻干于液氮中或冻干保存于冷却至 -30°C 的异戊烷中。将组织进行切片并转至经聚赖氨酸处理的载玻片上。于 -80℃ 储存组织切片。

杂交前从 -80℃ 取出载玻片并于室温下直接置于 4% 甲醛中 1 h。用 PBS 或 2X SSC 彻底洗涤。

对于任何 ISH 实验，为取得成功的结果，此步最为重要。每一个杂交系统，均需要它自己的最佳预处理方案。预处理的设计根据这样一个原则：既能使探针与抗体的结合物便于接触到靶分子，又能使组织保持原有的形态结构，并使靶分于保持它原有的位置。另 外，预处理方案还可用于设置 ISH 所必需的一些对照实验。

4. 杂交和洗涤

杂交严格件的控制可通过杂交步骤屮的温度、盐浓度和平酰胺的浓度来控制。但是更方便的控制是将这些参数应用到杂交后的严格洗涤上。

(1) 杂交缓冲液于 37℃ 预热 15 min，按 1：1 比例用去离子甲酰胺稀释，充分混匀。

(2) 于杂交缓冲液中加入所需量经 55℃ 预热的探针。300~600 ng/ml 的探针浓度适用于大多数杂交。

(3) 用适当体积的杂交缓冲液/探针混合物覆盖切片。

(4) 将切片放在的电热板上，放置 3~6 min。保温时间取决于靶的类型。

(5) 置切片于湿盒中，按所需温度（典型的是 55℃ ) 及时间进行杂交。

(6) 按所需的严格程度洗涤玻片。典型的洗涤程序包括：1X SSC-0.1%(V/V) SDS 于室温洗两次，每次 5 min；0.2X SSC-0.1%(V/V) SDS 于 55°C 洗两次，每次 10 min。

(7) 为降低本底，可用 RNase 对 RNA 探针进一步处理。此步仅仅除去未杂交的单链探针。具体步骤如下：玻片于 2X SSC 中淋洗 2 min 后，于预热的 2X SSC 液（含 RNase A 10 μg/ml ) 37℃ 保温 20~30 min。在进行下一步骤之前，于 2X SSC 中淋洗玻片。

5. 封闭、抗体保温和洗涤

在以下一系列保温中均需轻轻晃动玻片，除非特别声明，否则均于室温下进行。注意：此处所用的 TBS 比标准 TBS 所含的盐浓度更高。

(1) 玻片于 TBS 中洗 5 min。

(2) 置玻片于封闭溶液中保温 1 h。

(3) 于 TBS 中淋洗玻片 1min，沥干玻片上的缓冲液，如有必要，吸干每张玻片表面切片周围的液体。

(4) 按 1：10000 比例，用含 0.5%( m/V ) BSA 组分 V 的 TBS 稀释抗荧光素碱性磷酸酯酶结合物。用抗体覆盖薄片（每张玻片通常用 100 μl），静置保温 1 h。

(5) 玻片于 TBS 中洗 3 次，每次 5 min。

6. 检测

(1) 玻片于检测缓冲液中洗 5 min，沥干每一张玻片上的液体，如有必要，吸干玻片表面切片周围的液体。

(2) 取 45 μl NBT 储存液和 35 μl BCIP 储存液加至 10 ml 检测缓冲液中。每张切片加 500 μl 检测试剂，置于暗处显色 4~24 h。

(3) 用蒸馏水淋洗玻片两次，每次 2 min。

(4) 如需要，进行复染。加上封片剂，并盖上盖玻片。

(5) 于光学显微镜下观察结果。