非洲爪蟾的整体原位
实验材料 | |
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试剂、试剂盒 | 2% (m V)半胱氨酸 pH 7.8MEMPFA缓冲液PBS50%75%甲醇 灭菌水100%甲醇25% 甲醇 PBTPBT : PBS 中加 0.1% (V V) Tween-20 pH 7.8 PBT中加0.1 mol L三乙醇胺(TEA)缓冲液 pH 7.8 (未使用PBT时) 新鲜配置乙酐预杂交溶液B杂交溶液B:预杂交溶液B中加入1μg ml地高辛标记的核酸探针 |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 1) 在2%半胱氨酸,pH 7.8的溶液中培养非洲白化爪蟾的胚胎3〜10 min以除去胚胎外的胨胶层。 2) 将胚胎转移到5 ml螺旋盖玻璃小瓶中,等胚胎沉淀后,移去大部分的液体,并向小瓶中加入MEMPFA缓冲液。室温下培养30 min并轻轻摇晃以固定胚胎。 3) 用PBS取代MEMPFA缓冲液室温下洗3次,每次30 min。 4) 依次用50%、70%和100%甲醇室温下使样本脱水,每种溶液浸泡10 min。 5) 室温下用100%甲醇洗3次,每次10 min。-20℃保存。 6) 依次加入1 ml的75%、50%和25%甲醇/PBT,室温温育5min,使样本再水化。 7) 室温下用PBT洗3次,每次5 min。使用玻璃针将胚腔刺破。 8) 用 500μL PBT 中加 0.1 mol/L TEA 缓冲液,pH 7.8 洗 2 次,每次 5 min。 9) 加入1. 25μL乙酐。室温下摇动试管5 min,再加入1.25μL乙酐,再摇5 min。 10) 1 ml PBT溶液洗2次,每次5 min。 11) 室温下再用新鲜加入的1 ml PBT和250μL杂交溶液B洗10 min。 12) —旦胚胎在溶液中沉下,用500μL新鲜的预杂交溶液B预杂交:在60℃摇晃的水浴中孵育10 min。 13) 换成500μL新的预杂交溶液B,60〜65℃预杂交5 h以上。 14) 用加有1μg/ml地高辛标记探针的500μL杂交溶液B,60〜65℃杂交过夜。 15) 接下来用酶探测RNA杂交物 |
注意事项 | 所有的溶液都要经过DEPC处理或者高压灭菌以抑制RNA酶活性。样本干燥会导致背景的增强,整个过程中样本都要有液体覆盖以避免干燥。因此,换液时始终保持样本上覆盖一定量的液体。这样做同样可以避免物理损坏或者丢失样本。在固定步骤中保持胚胎处于悬浮状态是很重要的,因为不这样做样本就会变平。如果同时需 要分析很多胚胎,则需荽使用一个较大的容器(如一个大闪烁管)以避免胚胎聚集成块 |
杂交
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