对于确定的固定相，混合物样品中不同的化合物在层析板上爬升的速度不同，这是由于它们对于固定相的吸附能力不同，对于洗脱剂的溶解能力也不同。改变不同的洗脱溶剂，或用不同溶剂配成混合洗脱剂，化合物的分离效果可自行调节。组分在板上的分离情况一般用比移值（Rf）的大小来表征。薄层色谱板上的分离情况还可用于预测柱色谱或快速柱色谱的分离效果。
由于薄层色谱中很难产生均匀的吸附剂涂层，且薄板的质量与吸潮程度亦参差不齐，所以即便是同一物质在同类型而不同的层析板上得到的比移值也难以完全一致。相比于纸色谱这是薄层色谱的缺点。操作中常常将标准试样与试样在同一薄板上同时展开并点上混合点，以克服这一缺点。
化合物的分离是利用化合物与流动相之间在固定相上竞争结合位所造成的。例如：使用硅胶做为固定相的话，此固定相可以被视为极性。此时加入两不同极性的化合物，极性较强的化合物与硅胶间会有较强作用力，因此，更能抵抗流动相并与硅胶结合；极性较弱的化合物与硅胶的作用能力较差，因此更容易流动，拥有更高的Rf値。如果流动相的极性变得更强的话，这样更能够抵抗化合物与胶上结合的能力，使所有TLC片上的化合物上升到更高的位置。这样的溶剂我们称为"强"溶剂(洗脱剂)，而"弱"洗脱剂则几乎不能移动它们。"强"与"弱"的比较是取决于TLC片上的涂层(固定相)。