T7RNA聚合酶／启动子表达实验

实验材料 载体

试剂、试剂盒 氨苄青霉素卡那霉素pGP裂解缓冲液

仪器、耗材 培养箱分光光度计离心机

实验步骤

1.  将含有待表达基因的片段亚克隆于pT7-5、pT-6或pT7-7中，转化一种标准大肠杆菌菌株，此菌株不应带有可指导T7 RNA聚合酶合成的质粒。转化物涂布于氨苄青霉素平皿，于37℃温育培养过夜。

2.  挑取独立的转化菌落于LB/氨苄青霉素培养基中，37℃培养，通过小量制备方法获得质粒DNA。以限制性酶谱分析确证基因正确插入与否。 

3.  从pGP1-2转化大肠杆菌K38株涂布LB/卡那霉素平皿上，30℃下培养过夜（24 h）。挑取单个的转化菌落于LB/卡那霉素培养基中，30℃培养。

4.  将一含有Pt7控制下的待表达基因的载体转化入大肠杆菌K38/pGP1-2，于LB/卡那霉素培养基上生长（转化期间细胞可经热激处理），将转化物涂布于LB/氨苄青霉素/卡那霉素平板上，30℃培养过夜。

5.  挑取含两种质粒的大肠杆菌单菌落，接种于5 ml LB/氨苄青霉素/卡那霉素培养基中，30℃下培养过夜。

6.  按1：40比例稀释1 ml 过夜培养物，30℃下于LB/氨苄青霉素/卡那霉素培养基中长数小时，直至OD394≈0.4。

7.  速将温度升高至42℃，继续培养30 min，诱导T7 RNA聚合酶基因的表达。

8.  将培养温度降至37℃，继续温育90 min 后，离心收集细胞。

9.  通SDS-聚丙烯酰胺电泳分析诱导产生的蛋白。将相当于1.0 ml 培养液中的细胞重悬于0.1 ml 裂解缓沖液中，100℃加热5 min 后，立即将各样本以每份20 μl 的量加到SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。可取10 μl 细胞制备适当的细胞提取物检测诱导后的酶活性。