PacBio测序有望掀起下一场遗传诊断的革命

　　从一代到二代再到三代，近年来测序技术的发展势不可挡。单分子测序也逐渐表现出它的优势，在测序舞台上发挥着举足轻重的作用。近日，比利时鲁汶大学和瑞典乌普萨拉大学的研究人员在《Nucleic Acids Research》发表综述文章，介绍了PacBio SMRT测序技术在临床中的应用。

　　文章简单回顾了测序技术的发展史，从第一代的Sanger测序，到第二代以Illumina为代表的短读长高通量测序，再到第三代的单分子测序技术，包括SMRT测序和纳米孔测序。单分子测序的优势在于读长特别长，超过20 kb。因此，它们能够测序重复元件，直接定相变异，甚至直接检测表观遗传修饰。

　　“SMRT测序开辟了新的诊断途径，比如通过单次检测能以单碱基分辨率确定串联重复的长度、序列中断，甚至表观遗传修饰，”作者写道。“对于某些应用，长读长测序已被认为是金标准，如组织移植时的HLA基因分型。”

　　随后，文章还回顾了SMRT测序在多个领域中的应用，包括串联重复疾病、HLA分型、生殖基因组学、癌症，以及微生物和病毒遗传检测。

　　串联重复异常引起了40多种神经细胞疾病，包括脆性X综合征、脊髓小脑性共济失调等。SMRT测序研究的第一个串联重复是FMR1的CGG重复。健康个体携带大约30个CGG重复，若重复数超过200个，则会造成脆性X综合征。作者指出，用更快更直接的SMRT测序来取代Southern Blot，将大大提高FMR1及其他重复疾病的诊断水平。

　　HLA区域的基因分型，对诊断自体免疫疾病以及在器官移植中选择供体很关键。这个区域的基因是高度多态性的，这使得此区域很难用短reads来定位，而长reads有了用武之地。目前，许多大型的HLA分型实验室都利用SMRT测序来分析I类及II类的等位基因。这项技术逐渐成为器官移植和干细胞移植中的金标准。

　　在癌症方面，SMRT测序技术也应用于一些白血病的诊断。慢性粒细胞白血病（CML）由9号和22号染色体之间的易位引起，产生了BCR-ABL1融合蛋白。CML患者通常用酪氨酸激酶抑制剂来抑制BCR-ABL1，但可能诱发耐药性的点突变。因此，需要对TKI治疗效果不佳的患者筛查BCR-ABL1基因。研究表明，SMRT测序能够检测到低至1%的TKI耐药突变。

　　在传染病方面，SMRT测序已经被用于流感病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒的分析。HCV和HIV是长度约为9 kb的RNA分子，HBV是大小为3 kb的环状DNA病毒，都很适合SMRT测序。除了确定感染病毒的基因组序列，测序还能监控因药物治疗而引起的突变。

　　作者认为，从经济上考虑，全基因组和转录组测序目前只适合科研，但在不久的将来，PacBio系统将成为诊断的选择。关于Iso-Seq方法，“随着成本的下降和产量的增加，无偏向的PacBio表达和异构体检测将在不久后变得常规，”他们写道。

　　作者在最后总结道，SMRT测序因容易出错而不适合诊断的说法已经过时，如今的证据表明它相对短读长测序而言另有优势。正如第二代平台超越Sanger测序并掀起基因组医学的革命一样，第三代的单分子测序平台有望掀起下一场遗传诊断的革命。