把色谱柱加热到80℃会发生什么？

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Proteonavi S5的溶出行为2 & 3

～与他社色谱柱的比较及柱温80℃下的耐久性及峰形考察～

Keywords :Proteonavi, 肽类, 缓激肽, 后叶催产素, 血管紧缩素II, 神经降压素, 血管紧缩素I, 环孢菌素A, 表面活性肽, 0.1 vol% HCOOH, 柱温80℃, 耐久性, 峰形

～与他社色谱柱的比较～

ProteonaviS5是一款以孔径为30 nm的硅胶作为基材、键合C4基团的蛋白质・肽类化合物分析色谱柱。

上回的Espresso中介绍了以6种蛋白质作为样品，将Proteonavi S5与他社色谱柱进行溶出行为的比较的试验。（Proteonavi S5的溶出行为1～与他社色谱柱的比较～）

本次，我们以5种肽类化合物（缓激肽、后叶催产素、血管紧缩素II、神经降压素及血管紧缩素I）作为样品，将Proteonavi S5与一款填料表面带有正电荷的他社杂化型色谱柱（孔径13 nm、粒径3.5 μm）的溶出行为进行比较，所得结果见图1。

▲图1 两款色谱柱分析所得色谱图

其中，流动相条件为添加0.1 vol%甲酸的水-乙腈系统，在梯度条件下进行分析，对这两款色谱柱进行了溶出行为的考察。

如图1，他社色谱柱对5种肽类化合物的整体保留较弱，且缓激肽峰未能得到确认（被吸附而未能溶出）；与此相对，Proteonavi S5对这5种肽类化合物均得到了良好的色谱峰形及充分的保留与分离。

～柱温与溶出行为～

对肽类化合物进行分析时，有提高柱温的做法。例如，《第17改正日本药局方》中，环孢菌素是在柱温80 ℃附近的一定温度下进行分析的。

在此，以环孢菌素A作为原料，在等度条件下对色谱柱柱温变化及相应的溶出行为进行了考察。图2为所得结果。

环孢菌素A (M.W. 1202.6)

Cyclosporin A

▲图2 柱温与环孢菌素A溶出行为的关系

如图2，随着柱温的上升，环孢菌素A的保留逐渐减弱，峰形也愈发尖锐。

一般，与小分子相比，大分子的扩散速度较慢，因此色谱峰形有展宽的趋势，而设定较高的柱温可以使峰形变得尖锐。

就像这样，常规情况下，在对肽类化合物进行分析时，设定较高柱温可以使分析时间缩短，并提高定量准确性。（敲黑板！）

～80℃下的耐久性考察～

接下来，在柱温80 ℃条件下对Proteonavi S5的耐久性进行了考察。

图3为首次进样与连续进样第500针所得色谱图，图4为进样500针的环孢菌素A保留时间维持率（％）。

▲图3 首次进样和连续500次进样所得色谱图

▲图4 环孢菌素A的保留时间维持率（％）

如图3、4，对Proteonavi S5进行80˚C条件下的连续耐久性试验，在连续500次进样过程中（通液时间共计250小时），环孢菌素A的峰形几乎没有变化（理论塔板数N及对称因子S），同时，保留时间维持率近乎100%（首次进样与第500次进样对比，具体数值为99.4%）。

综上，Proteonavi S5色谱柱即使在80 ℃的高柱温条件下也能得到非常稳定的分析结果。

对于环孢菌素A这样的大分子化合物，随着柱温的上升，其扩散速度加快，因而峰形会更尖锐。

进一步，针对提高柱温的效果，以环状肽类化合物表面活性肽（M.W. 1036.3）作为分析对象，将柱温分别设定为40 ℃和80 ℃进行分析，图5为分析所得结果。

表面活性肽 (M.W. 1036.3)

Surfactin

▲图5 柱温40 ℃及80 ℃条件下

对表面活性肽的分析色谱图