CASMS分论坛：相互作用组学和结构蛋白质组学前沿

  分析测试百科网讯 美国东部时间2021年8月9日-13日，首届美国华人质谱学会（CASMS）学术研讨会暨展览会在Gather.Town隆重举行。8月11日的“Frontiers in Interactomics and Structural Proteomics” （相互作用组学和结构蛋白质组学前沿进展）分论坛由加利福尼亚大学尔湾分校HuangLan（黄岚）教授主持。来自荷兰乌特列支大学的Albert Heck博士、北京生命科学研究所的董梦秋研究员、美国匹兹堡大学医学院的Yi shi博士、美国华盛顿特区乔治华盛顿大学化学系的Ling Hao博士、美国佐治亚理工学院化学与生物化学学院的Ronghu Wu 博士、美国加利福尼亚大学尔湾分校生理学与生物物理学系的黄岚教授分别做精彩报告。分析测试百科网作为大会支持媒体，为您带来全程跟踪报道。 

荷兰乌特列支大学生物分子质谱和蛋白质组学部门Albert Heck博士

报告题目：Higher Order Organization of the Plasma Proteome

  Albert Heck博士首先介绍了血浆蛋白质组的研究方法，其关于COVID-19的最新研究成果发表在Life Science Alliance上。血浆中的很多蛋白是糖蛋白研究组用Native MS（非变性质谱） Orbitrap技术来分析糖型，并举例了人促红细胞生成素的非变性质谱分析。课题组结合非变性质谱和Middle-Down的一体化蛋白质组学方法来分析糖蛋白，即用非变性质谱分析糖型，并酶解后用Middle-Down组学方法来定量特定位点的PTM（翻译后修饰），后者重组后的数据和前者非常吻合。

Fetuin是一种研究败血症有意义的血浆蛋白，课题组进样100uL血浆用离子交换色谱分离，截取出有效的胎球蛋白（fetuin）馏分再进行分析。课题组分析了20个有独特糖型志愿者的血浆后，研究其糖型特点；研究了血浆蛋白质组的高阶结构：结合珠蛋白（haptoglobin），用非变性质谱和top-down策略研究了源自不同基因型的haptoglobin的四阶结构、糖基化和血红蛋白结合特性。课题组还使用交联质谱技术并研发了PhoX简便快速的富集技术，并介绍了胶上交联（IGX-MS）技术，研究了膜攻击复合物的组装体（MAC），用交联质谱和冷冻电镜观察研究了各种sMAC结构。

北京生命科学研究所 董梦秋研究员

报告题目：Ten Seconds of Lysine-Lysine Cross-linking under Denaturing Conditions Using di-ortho-phthalaldehyde (DOPA) Enables Mass Spectrometry Analysis of Protein Unfolding

  董梦秋博士首先表示，今年AlphaFold 2和RoseTTAFold人工智能在预测蛋白结构方面的新闻振奋人心，结构生物学从“快照”走向“电影”，不再仅研究静态的结构，而可以研究动力学和构象变化，这些对于结构蛋白质组学来说充满机遇和挑战。她接下来简介了交联质谱技术（CXMS/XLMS/CL-MS），但过去仅限于研究静态结构，因为构象变化太快，交联反应太慢，比如使用NHS ester交联剂的交联反应常为数十分钟到2小时。课题组研究了一种新型仅需10秒钟的交联反应，使用DOPA2交联剂，快速的非水解型K-K交联剂。文献最早报道的OPA（邻苯二甲醛）已比NHS ester快3-7倍，课题组进一步研发了DOPA2，在SDS-PAGE上交联仅需10秒（比DSS快60-120倍），在酶解后的LCMS分析中仅需10-20秒，用FRET（荧光共振能量转移）方法也观察到10-20秒的交联时间。研究还发现，DOPA2的交联可发生在变性剂存在情况下。接下里举例介绍了SNase（葡萄球菌核酸酶）的交联质谱分析，在尿中SNase有两种过渡态，用DOPA2交联了两种SNase过渡态并观测了各自结构，并发现了新的loop连接。在尿中RNase A的交联质谱分析中，在不同时间点、不同浓度下取出样品，可观测到有趣的不同结果，并可进行分子动力学模拟RNase A的各种非折叠中间体。DOPA2可在10秒交联，可耐受尿液和GdnHCL，虽然对于“录像”更多构象还不够快，但已经迈出了重要一步。 

美国匹兹堡大学医学院，Yi shi（时毅）博士

报告题目：Proteomics Facilitates the Development of A Novel Inhalation Therapy for the Evolving COVID-19 Pandemic（蛋白质组学有助于发展新的吸入疗法，以应对不断演变的新冠病毒-19大流行）

  Yi shi博士介绍了纳米抗体（Camelid Nanobodies，Nb）的特点，分子量小（约15000 Da）非常稳定可溶性高，低成本快速生产，易于生物工程，在可吸入方面有潜力，生物安全性高；其高通量、高质量、稳定和快速的特性非常吸引人。Yi Shi博士进一步介绍了其表征方法，特性并分析了其机理。在过去的一年里，时毅教授的研究团队与合作者通过给大羊驼免疫，并结合先进的蛋白质组学平台技术，快速鉴定了超过8000个纳米抗体，可以强效结合新冠病毒受体结合域（RBD）。这些高亲和的纳米抗体水溶性好，稳定性高，适合低成本快速生产。稳定的纳米抗体可以通过气化喷雾吸入，用于治疗病毒引起的肺部感染。在仓鼠模型中，研究团队首次证明了可吸入纳米抗体的高效率，只需超低剂量（0.2mg/kg）吸入，就可在动物感染新冠病毒后迅速起到保护作用，将肺内病毒颗粒数量降低为百万分之一。总结来看，该研究为Nb药物发现建立强大蛋白质组学通路，发现了高效中和病毒的纳米抗体，多价结构的生物工程提高效力<0.1ng/mL，使用稳定的雾化Nb进行高效吸入治疗，结构研究揭示了三类中和Nbs，并提供了潜在抗病毒药物的见解机制，两类对挥发性有机化合物具有高度抗性，使用Nb鸡尾酒疗法可最大限度地减少突变逃逸。

美国华盛顿特区乔治华盛顿大学化学系，Ling Hao博士

报告题目：Developing Proximity Labeling Proteomics Strategies for Neurodegenerative Diseases（神经退行性疾病邻近标记蛋白质组学研究进展）

  Ling Hao博士介绍了课题组发展的基于质谱的技术，开展邻近标记蛋白质组学技术，介绍了其技术挑战，讨论了可裂解生物素化。在神经退行性疾病研究方面，研究了溶酶体功能障碍，线粒体功能障碍等。蛋白-蛋白的相互作用可分为稳态作用，瞬态作用，和邻近蛋白质。邻近标记（PL）技术使用PL酶，捕获稳态、瞬态蛋白相互作用和分子的微环境。课题组发展了Lysosomal PL（溶酶体邻近标记）蛋白质组学技术，观察蛋白的相互作用。PL-MS存在的技术挑战包括：高丰度内源性生物素化蛋白质，实验条件变化，链霉亲和素污染，缺乏生物素化位点信息等，课题组发展了各种方法来应对上述挑战。

美国佐治亚理工学院化学与生物化学学院，Ronghu Wu 博士

报告题目：Effective Mass Spectrometry-Based Methods to Globally Analyze Glycoproteins on the Cell Surface and Their Interactions（基于质谱的有效方法全面分析细胞表面的糖蛋白及其相互作用）

  Wu博士首先简介了研究细胞表面糖蛋白的重要性。课题组发展了有效的基于质谱的技术来靶向分析细胞表面糖蛋白。研究不同类型的人类细胞后发现，表面糖蛋白独特和差异的表达决定了细胞类型，因此课题组研究其动力学，对细胞免疫应答不同期间细胞表面糖蛋白进行定量来研究动力学。用LPS处理后，进行时间分辨的定量，研究并比较了单核细胞、巨噬细胞的表面糖蛋白定量动力学，比较分析了其主要差异和特异的位点变化，在用交联选择性富集后分析表面糖蛋白的相互作用，并构建了细胞表面蛋白质相互作用组，对交联肽的鉴定揭示出表面直接的相互作用。总体而言，课题组发展了集代谢标记，生物正交化学和基于质谱的蛋白质组学技术来特异地分析细胞表面的糖蛋白，对病毒感染的细胞表面糖蛋白的动力学进行定量，鉴定了IGSF8和TSPAN3等新的表面糖蛋白并揭示其糖基化位点的变化；通过综合利用化学交联、选择性富集和蛋白质组学技术，全局性分析了表面糖蛋白的相互作用，鉴定了表面蛋白的直接作用。

美国加利福尼亚大学尔湾分校生理学与生物物理学系，黄岚教授

报告题目：Developing Cross-linking Mass Spectrometry to Define Interaction and Structural Topologies of Protein Complexes（发展交联质谱以确定蛋白质复合物的相互作用和结构拓扑）

  黄岚教授首先简介了XL-MS（交联质谱）分析方法，课题组发展了DSSO（Disuccinimidyl Sulfoxide）交联剂，并介绍其在一级质谱、二级质谱、三级质谱的表现，通过MSⁿ技术可非混淆地准确鉴定DSSO内交联的肽段。课题组还发展了一系列如DHSO、BMSO等交联剂，并已同Sigma、赛默飞、Cayman等建立了商业合作。黄教授继续介绍了包含亚砜的质谱交联剂的交联质谱分析策略，如PPI Mapping，分析构象变化、结构模型等，比较了DSSO、DHSO、BMSO交联距离的尺寸变化，因此可应用多种交联剂的策略来分析蛋白质复合物的综合结构模型，介绍了其在活体PPI研究中的成功应用。随后黄教授介绍了具有杂化双功能光反应的含亚砜交联剂来研究蛋白复合物，在基于SDADO的交联质谱分析策略方面，课题组分析了26S 蛋白酶体原子模型，用XL-PPI研究26S 蛋白酶体的网络拓扑结构，被双吖丙啶（Diazirine）靶向的氨基酸分布。

  总体而言，课题组发展了一系列含有亚砜的质谱裂解交联剂，在蛋白复合物的结构分析中可快速准确鉴定交联多肽，基于SDASO的交联多级质谱工作流程，可以对大蛋白复合物进行光活化交联质谱分析，比较而言，SDASO交联剂稳定，并捕获与残基特异性试剂互补的相互作用。

  关于Frontiers in Interactomics and Structural Proteomics分论坛演讲人的简介，请见：http://www.casms.org/?action=content&id=61