【分享】影响westernblot实验的七大因素

　　Western blotting是一个步骤繁多的实验，实验中的每一步都会对最后的结果产生影响，电泳过程是第一步，也是很重要的一步，好的电泳能让目的条带整齐，就像人工画的。以下是总结的一些影响实验结果的因素：

　　1. 样品质量。所抽取样品的蛋白含量，蛋白变性是否充分等等，还有，蛋白样品的PH值是否在7~8之间。这会直接影响到样品浓缩的效果。此外，蛋白样品是否降解、目的蛋白是否已抽取充分都会对最终结果的可靠性有影响。

　　2.凝胶质量。不连续SDS-PAGE胶对凝胶的要求较高，具体的影响因素有：（1）分离胶的PH值应在8.8左右，而浓缩胶的PH应在6.8左右，最好不要差过0.5个PH单位，因为这个PH条件是保证电泳液中的甘氨酸不电离的必要条件，也是保证能充分压缩样品的前提。因此，制备凝胶的时候所用Tris-HCl缓冲液的PH值是否稳定是很重要的。（2）用丙烯酰胺的纯度和凝胶聚合时间，不纯的丙烯酰胺会含有丙烯酸，它会影响到凝胶内部局部PH环境，因此会影响电泳的效果，没有聚合充分的凝胶会含有游离的丙烯酰胺，也会影响到局部PH环境，它们还会与蛋白上的氨基、巯基以及酚羟基反应影响蛋白的泳动。凝胶聚合时间以分离胶>45min，浓缩胶>20min为宜。此外，单体放置时间过长也会造成丙烯酸的累积。（3）凝胶母液混合是否均匀也会影响到凝胶浓度的分布。（4）配备的母液中丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺的比例也会影响到网孔的大小，因此也会对电泳的质量有影响。（5）APS及TEMED的加入量，APS极易潮解而失去活性，因此最好是现用现配，APS不宜加入过多，否则会氧化蛋白样品。（6）点样孔底部要平整。

　　3. 点样。样品尽量不要与电泳液混合，这样能提高浓缩的效果，因为电泳液PH值为8.3，而样品为7.5，混合后会影响到样品的PH值，进而影响浓缩效果。因此，建议点样最好用长枪头，或者加样器，轻轻的将样品加到孔的底部。还有，加样之前最好先冲洗一下加样孔

　　底部，减少没有聚合的丙烯酰胺的影响。尽量从加样孔的中间点样，这样能使得样品在加样孔中的浓度分布尽量均匀，这也会对最终蛋白条带的形状有影响的。加样量也不能过高或过低，过高会影响条带的形状，过低不利于后面的杂交反应。

　　4. 电泳缓冲液。尽量用新鲜配制的。这样能保证PH值和离子强度的稳定。

　　5. 电压条件。电压过高，一方面会使凝胶温度上升，改变凝胶内部PH值，甚至会造成溶胶，另一方面，电流过大也不利于蛋白分子的分离，容易造成条带变形，电压过低，又会有样品扩散的影响。我们经常用的浓缩时80V，分离时100V比较好，条带很平。

　　6. 转膜。首先是膜的选择，主要从实验目的和实验要求来考虑。例如，要做分子量小于20kD的小蛋白，0.45μm的NC膜是不可取的，因为这样可能会使得蛋白因透过膜孔而造成膜结合的目的蛋白量不确定，从而影响到最终结果的可靠性。而如果所分离的蛋白需要进行测序，则非PVDF膜不可，因为只有PVDF膜才能经受住严酷的清洗条件。其次是转膜方法的选择。主要有半干法转膜和湿法转膜。半干法操作要求高，但效率也高。湿法操作要求相对低，花时间多一些。

　　7. 抗体杂交与底物显色。一抗尽量选择小鼠或者兔来源的单克隆抗体，还有要注意所用的抗体是否能够识别变性条件下的目标蛋白；二抗一般都是效价很高的，只要室温下杂交1小时就可以了，适当延长也是可以的。另外，要选择灵敏度较高的化学反应底物。如英格恩生物的超敏型ECL发光液Enlight-Plus，检测级别可达pg级，发光时间长，稳定。