清华大学Nature子刊：利用Cas9实现基因克隆

　　来自清华大学、中科院微生物研究所的研究人员报告称，他们开发出了一种新技术，通过Cas9辅助靶向染色体片段（CATCH），可一步靶向克隆出大基因簇。这一重要的研究成果发布在9月1日的《自然通讯》（Nature Communications）杂志上。

　　 清华大学的朱听（Ting Zhu）研究员、特拉维夫大学的Yuval Ebenstein，以及中科院微生物研究所的娄春波（Chunbo Lou）研究员是这篇论文的共同通讯作者。

　　 在工程改造生物体以生成高附加价值的生物分子，诸如药物制剂和生物燃料的相关研究工作中，克隆大基因簇的长基因组片段是其中一个重要的步骤。传统基于PCR的克隆方法往往受到序列长度和DNA模板GC含量的限制：标准PCR反应常规可生成长度为10kb的片段，而获得更长的PCR产物则需要繁琐地去优化反应条件，即便在理想的条件下通常也限制在35

　　kb。或者，可以通过组装多个短片段，如重叠PCR产物或化学合成的DNA寡核苷酸来生成感兴趣的长基因组序列，但这样的方法往往费时且昂贵，尤其是想要获得长度大约50

　　kb的序列时（这通常需要3-5个阶段，每个阶段包含多个组装事件）。

　　 另一个获得长基因组序列的途径就是采用限制性酶来消化基因组DNA。然而，作为一种非靶向性方法，从大量的限制性消化产物中挑出特异的目的序列非常具有挑战且麻烦。某些技术如转化介导的重组克隆方法（TAR）和单链逐次退火，已被用于在限制性酶消化后来特异性克隆长细菌基因簇。但这些技术的应用仍然受到限制，因为它们依赖于在靶基因组区域两边获得独特的限制位点，并且在靶序列中存在选择标记物。为了推动生物技术和合成生物学进步，开发出一种通用方法来克隆常规方法难于获得的几乎任意的长基因组序列至关重要。

　　 向导RNAs可以引导CRISPR-Cas9核酸酶来切割靶DNA的特异序列。就酿脓链球菌（spCas9）来说，向导RNA系统由CRISPR RNA （crRNA）和反式激活crRNA（tracrRNA）构成——二者可融合形成单链向导序列（single guide RNA， sgRNA）。靶向序列包含与crRNA互补的前间隔序列（protospacer）和.前间隔序列邻近基序（PAMs）。相比于传统的限制性酶有着限制为4–8

　　bp的固定识别位点，使用长的（~20

　　bp）、可编程的前间隔序列来作为识别位点，可为spCas9核酸酶系统提供高度的靶向特异性和通用性。这已推动广泛开发出了用于基因组编辑、序列特异性控制基因表达、体内成像的基于Cas9的工具。相比之下，尚未充分探索Cas9系统的体外潜在应用；研究人员主要将焦点放在了测试Cas9的切割效率和序列识别特异性上。

　　 在这篇文章中研究人员证实spCas9除了是一种通用的基因组编辑工具，体外应用spCas9可以前所未有的效率和简易性克隆大基因簇。他们描述了一种技术，其能够一步靶向克隆几乎任意的、长达100kb的长细菌基因组序列。在体外借助于RNA引导的Cas9核酸酶在两个指定位点从细菌染色体中切下目标基因组片段，然后通过Gibson组装将其连接到克隆载体中。这一技术可成为目标克隆大基因簇一种有效的分子工具。