清华大学Nature子刊：将Cas9应用于分子克隆

　　在4月21日的《自然实验手册》（Nature Protocols）杂志上，清华大学的朱听（Ting Zhu）研究员与博士生姜文君（Wenjun Jiang）撰文，详细介绍了利用一种叫做Cas9辅助靶向染色体片段（CATCH）的方法，靶向分离及克隆100kb微生物基因组序列的优化实验方案。

　　朱听研究员的主要研究方向包括合成生物学、人造细胞；新一代高通量DNA测序、宏基因组学；高通量DNA测序在癌症和传染病等疾病领域中的应用；生命的起源、远古生命与极端条件下生命体的发现与测序。

　　随着各种微生物基因组测序工作的不断完成和序列信息的大量累积，微生物基因组研究的重点已从结构基因组学转为功能基因组学，大量未知功能的基因和基因簇有待大家去解析。在细菌的基因组中，功能密切相关的基因常聚集在一起，形成一个大的基因簇或操控子。很多细菌的基因组中存在基因组岛，与细菌的毒力、耐药等密切相关，它们常作为一个整体在细菌之间进行转移。要分析基因簇或基因组岛这些长基因组序列的功能，需要对整个基因簇或基因组岛进行遗传操作。

　　DNA克隆是基因功能研究中最为基础和关键的内容。目前，PCR是DNA克隆中最常用的方法。但该方法可在产物中引入突变，并且随着PCR产物长度的增加，突变率也增加。另一个获得长基因组序列的途径就是采用限制性酶来消化基因组DNA。然而，作为一种非靶向性方法，从大量的限制性消化产物中挑出特异的目的序列非常具有挑战且麻烦。因此，常用传统PCR或限制性酶消化通常难于直接获得这样的长基因组序列，克隆这些序列仍然是分子生物学中一个技术障碍。

　　在2015年9月的Nature Communications杂志上，朱听研究员与特拉维夫大学的Yuval Ebenstein，以及中科院微生物研究所的娄春波研究员合作，报告称他们开发出了一种叫做CATCH的方法，其能够一步靶向克隆几乎任意的、长达100kb的长细菌基因组序列。在体外借助于RNA引导的Cas9核酸酶在两个指定位点从细菌染色体中切下目标基因组片段，然后通过Gibson组装将其连接到克隆载体中。这一技术可成为目标克隆大基因簇一种有效的分子工具（清华大学Nature子刊：利用Cas9实现基因克隆 ）。

　　在这篇Nature Protocols文章中，作者们描述了CATCH克隆方法的一种优化实验方案。这一实验方案采用的是标准的实验室设备，仅需在几天内经历约8小时的实验时间，它有潜力简化及加速从微生物中分离及克隆大基因簇的研究工作。

　　所有的分子生物学家都会告诉你：将DNA片段克隆到载体中去是一件棘手的事情。研究人员要查看复杂的限制性酶切图谱，费尽心力找到适当的限制性内切酶组合，然后熬过漫长的连接和转化过程，希望能够生成少数正确插入的克隆。那如果能够摆脱所有这些繁琐的步骤，在任意位点切割质粒，然后无缝插入你的靶DNA，会怎么样呢？南佛罗里达大学Morsani医学院变态反应和免疫学部的研究人员转向了基因组工程系统——CRISPR/Cas9，开发出了体外“CRISPR克隆”法（华人学者技术突破：将CRISPR应用于分子克隆 ）。

　　来自荷兰Hubrecht研究所和乌特勒支医学中心（UMC Utrecht）、麻省理工学院的研究人员称，他们开发出了一种自身克隆CRISPR/Cas9(scCRISPR)技术，可以绕开基因编辑过程中所有的克隆步骤，在数小时内完成CRISPR/Cas9介导基因突变及位点特异性转基因敲入。他们的研究成果发布在2015年10月29日的《Stem Cell Reports》杂志上（Cell子刊突破：无需克隆的CRISPR新技术 ）。