用RNAseq快速绘制大脑图

　　在过去的十年中，DNA和RNA测序技术已迅猛发展并且更加便宜，现在它们被运用到各种新的领域中。最近在《Neuron》发表的一项新研究中，研究人员使用RNA测序技术，在单个神经元水平上绘制小鼠的大脑图。这种新技术被称为Multiplexed Analysis of Projections by Sequencing (MAPseq)，可能比目前的方案更快和更容易。延伸阅读：华人学者构建新的大脑图谱；《科学》：迄今为止最详细的大脑连接图 。

　　这项研究的第一作者、冷泉港实验室Anthony Zador教授的研究生Justus Kebschull说：“有了MAPseq，我们试图查明单个神经元最终到达哪里。”Zador的团队积极开发MAPseq，因为缺乏高通量方法来跟踪单个神经元。

　　在这项新的研究中，研究人员向一个选定的脑区，注射了一种含有大量RNA分子的失活病毒。每个RNA分子都有其独特的“条码”序列，每一个都在一个神经元中结束，并通过轴突。几天之后，研究人员解剖大脑，收集和测定来自不同脑区的RNA条形码。

　　通过将来自注射脑区与其他脑区的RNA条码进行匹配，研究人员可以追踪单个神经元最终到达哪里。Kebschull说：“这是利用测序和条形码用于高通量神经解剖学的第一个例子。”

　　快速地映射连接

　　弄清神经元是如何连接的，是理解大脑如何运作的一个重要组成部分。Kebschull说：“如果你认为大脑就像一台计算机，我们就需要知道什么与什么连接在了一起，比如硬盘是否连接到了处理器。”

　　在目前的许多脑成像技术中，研究人员都是在神经元中表达一种荧光标记，并用显微镜观察哪些大脑区域发光。但是Kebschull说：“每一个脑区有数千个神经元。”这些“批量跟踪”方法不能区分单个神经元，因此，研究人员无法区分两个源神经元最终到了同一区域，还是不同的区域。这是重要的信息。“不同的神经元可能具有不同的属性，并可能携带不同的信息。”

　　其他的脑成像技术可以跟踪单个神经元，但这些方法都是劳动密集型的和费时的。Kebschull说：“跟踪一个单一的神经元需要数周的时间。如果你想研究成千上万个神经元，你基本上完蛋了。”相反，MAPseq用了一个星期的时间，就绘制出了一个注射脑区的几千个神经元图，速度发生了一千倍的提升。

　　适应现有的工具

　　Zador和他团队的灵感来自以前的脑成像技术，如Brainbow，研究人员随机表达荧光标记物来标记不同的神经元，具有各种各样多种的颜色（2）。但使用显微镜能够容易区分的颜色数量有限，出于实际的目的，研究人员在这些模型中一次可以至多跟踪10个神经元。

　　Kebschull说：“有了MapSeq，我们考虑从颜色切换到随机核酸序列。”利用核酸条码序列，将提供更多样化的标志物，使用目前的高通量测序方法，这些可能是非常快速和相对便宜的读数。从30个核酸序列的一段序列开始，研究人员将最终获得1018个可能的序列，是小鼠大脑中神经元数量的10个数量级以上。

　　在2012年，Zador首次建议使用条码测序用于高通量的大脑映射，那么，研究人员必须弄清技术细节（3）。他们决定使用一种无效的Sindbis病毒——在神经科学中常用的一种工具，来将条码RNA序列运送到小鼠的神经元中。但他们马上遇见了一种并发症。

　　Kebschull说：“人们认为是非复制型的病毒，其实是复制型的。”因此，病毒粒子传播超越了初级感染的神经元，来标记其他神经元，这将使得映射分析变得复杂化。对于新技术，Kebschull制备了一种重组Sindbis病毒，能感染神经元，但不传播，为进一步改进铺平了道路（4）。

　　一旦RNA条码进入神经元，研究人员必须确保它们沿轴突运输到它们的终端。为此，他们添加了一种工程化的蛋白质，并表明它能有效地工作。此外，研究人员希望确保每个标记的神经元收到一个独特的条码，并且他们计算了必须注入多少病毒，才能实现这一目标。Kebschull和Zador也弄清了如何用高通量测序准确地识别条形码（5）。

　　测试技术

　　Zador的团队在小鼠大脑蓝斑（LC）的一部分中测试了MAPseq，这个脑区是一种激素去甲肾上腺素的来源。去甲肾上腺素可调节警觉性和专注力，来自LC的神经元是否延伸整个皮质或只到达特定区域，尚不明确。Kebschull说：“LC是一个很好的测试案例。”

　　使用MAPseq，研究人员发现从LC神经元投射出许多各种各样的图案，一些神经元到达一个特定的靶标，其他神经元则伸展的更广泛。因此，来自LC的去甲肾上腺素可以到达整个皮质，以及在特定区域有更严重的影响，这与以前的研究结果一致。

　　目前的研究只使用一种病毒注射到LC，Zador和他的团队正在努力增加寻找其他病毒。最终，他们希望利用MAPseq同时跟踪整个皮层的神经元。Kebschull说：“我们正在扩大这种方法，以开展更多的高通量神经解剖学。”研究人员还计划在不同疾病的小鼠模型中使用MAPseq。“我们可以研究不同的自闭症或发育疾病小鼠模型，以探析大脑的连接是如何错误的。”