施一公组首次报道人源剪切体原子分辨率结构

　　2017年5月12日，清华大学生命学院、结构生物学高精尖创新中心施一公研究组于《细胞》（Cell）在线发表了题为《人源剪接体的原子分辨率结构》（An Atomic Structure of the Human Spliceosome）。这是第一个高分辨率的人源剪接体结构，也是首次在近原子分辨率的尺度上观察到酵母以外的、来自高等生物的剪接体的结构，进一步揭示了剪接体的组装和工作机理，为理解高等生物的RNA剪接过程提供了重要基础。

　　在真核生物细胞内，大多数基因是不连续的，它们的编码区（exon）被称为“内含子（intron）”的非编码序列隔断。在基因表达过程中，内含子需要经过“剪”和“接”这两步化学反应被去除，从而使得编码区可以连接成不同的信使RNA（mRNA）。同一个基因，因为内含子的边界和数量不同，经过剪接，便可以产生出多种编码蛋白的mRNA。RNA剪接是所有真核生物特有的过程，是真核生物“中心法则”的关键步骤之一，也被认为是真核生物复杂性的重要分子基础。RNA剪接过程必须高度精准，任何错误都有可能导致基因表达异常乃至疾病的发生。据统计，1/3以上的遗传性疾病与RNA剪接异常有关。

　　RNA剪接这一复杂的生理过程由剪接体（spliceosome）来执行。剪接体是细胞中已知的最为复杂的大分子机器，分子量巨大并且高度动态，主要由蛋白质-核酸形成的复合物（ribonucleoprotein，RNP）组装形成，它在前体信使RNA（pre-mRNA）上完成识别、组装、激活、催化等一系列过程，并最终在反应结束后解离成许多小的功能单元，以进入下一个反应循环。根据剪接体的组成与构象的不同，可以将剪接体分为E、A、B、Bact、B*、C、C*、P、ILS等若干状态（图1）。

图1. 剪接反应过程示意图

　　解析剪接体的高分辨率结构对于理解剪接反应的机理至关重要。2015年8月，施一公课题组在世界上率先解析了酵母剪接体的高分辨率结构，在2016年又陆续报道了酵母剪接体在不同工作状态下的高分辨结构，提供了迄今为止最为全面和清晰的剪接体结构信息，揭示了RNA剪接的分子基础，极大地推动了这一领域的发展。

　　然而与酵母剪接体相比，以人类为代表的高等生物的剪接体组成、组装和调控更为复杂，其结构研究也因为组成的复杂性和构象的不稳定性而进展缓慢。由于超过1/3的人类遗传病与剪接过程中的错误直接相关，解析人源剪接体的结构不仅能帮助理解剪接反应的化学本质，更能促进对一些疾病发病机制的理解，并为研发针对剪接体的相关药物提供可能。因此人源剪接体的结构解析是极其重要并亟需解决的难题。

　　在最新发表的《细胞》研究长文中，施一公研究组利用修饰过的pre-mRNA，在体外进行人源剪接体的组装，把剪接反应锁定在了第一步反应之后与第二步反应之前的状态，即C*状态。由于人源剪接体非常不稳定，研究人员使用化学交联剂在温和的条件下对剪接体进行固定，成功获得了稳定的人源剪接体样品，并采用单颗粒冷冻电镜重构出了3.8埃的近原子分辨率结构（图2和图3）。

图2. 人源剪接体的结构示意图

图3. 人源剪接体与酵母剪接体的比较

　　在该结构中，剪接体核心区分辨率高达3.0-3.5埃，清晰地展示了由20余个蛋白与RNA组成的催化反应中心的结构（图4 ）。同时，他们观察到与第二步反应密切相关的剪接因子所呈现出的特定构象，对于稳定反应活性中心以及催化第二步转酯反应至关重要。该结构的解析为揭示第二步反应过程中剪接体的构象变化以及3 剪接位点的识别提供了重要的结构依据。

图4 人源剪接体的催化中心与调控机制

　　施一公教授为本文通讯作者； PTN项目15级博士生张晓峰、结构生物学高精尖创新中心卓越学者闫创业、医学院博士生杭婧为本文共同第一作者，闫创业博士同时为本文共同通讯作者；生命学院博士后Lorenzo I. Finci 参与了这项研究；清华大学冷冻电镜平台主管雷建林研究员协助数据收集，平台工作人员李晓梅、李晓敏在数据收集过程中提供了帮助；本课题得到了清华大学冷冻电镜平台，高性能计算平台、国家蛋白质设施实验技术中心（北京）的大力支持；本工作主要获得北京市结构生物学高精尖创新中心的经费支持，并获得了国家自然科学基金委以及科技部的资助。