荧光显微镜的原理及应用要点

　　荧光显微镜是利用特定波长的光照射被检物体产生荧光进行镜检的显微光学观测技术，已有100多年历史。近年来，由于免疫荧光在医学研究、诊断领域里的广泛应用，FISH、绿色荧光蛋白(GFP)技术分别在基因组学、蛋白质组学研究方面的推广，显微照相、数字CCD成像技术的辅助驱动，赋予这一传统技术更新的应用价值和生命力。

　　基本原理

　　荧光：是一种非温度辐射冷光，据发生性质可分为光化荧光(由特定光源光谱激发而产生的荧光)、放射荧光(放射性物质激发)、生物荧光(生物体发出)、化学荧光(如磷氧化时)等。

　　荧光现象：某物质在受到某种特定波长的高能量光(短波长)照射后获取能量，几乎即时(约在10～15s后)其分子内的电子跃迁到较高能级轨道使分子进入激发态，激发态的分子不通过内部转换方式消耗能量回到基态，而是释放出相应较低能量的光量子→人眼可见的荧光(较长波长)。

　　荧光现象有两种：一次荧光现象，又称“固有荧光”或“自发荧光”，是指经照射后，就能发出荧光的物质，此类物质的化学特征是发光分子具有共轭双键，π电子活动性大。二次荧光现象，又称“继发荧光”，物质经照射后不能或只能部分发生微弱的荧光，这样就需先用荧光色素(或称荧光染料、荧光探针)标记处理，将荧 光色素标记结合插入到不发光的活性分子中去，再经照射才能发生荧光。荧光色素应具备的基本条件是能与不发光分子的某个区域有特异性的牢固结合，同时不会影响被结合分子的结构和特性，光量子效率应≥013。

　　荧光的产生包含了激发(Excitation)和发射(Emission)两个过程，激发光谱短于发射光谱，故光色不同。而不同的荧光物质或荧光色素有其最敏感而有效的激发波长，因此选择合适的激发/发射光谱以获得最佳的荧光镜像质量是实验中要首先考虑的。

　　荧光显微镜是利用“光化荧光”成像，如果所选激发波长在肉眼所看不见的近紫外光区(320～400nm)，荧光的发射光谱也较普通光镜光源的平均波长短，光学分辨率提高。

　　应用要点

　　1)预检查和调节

　　(1)每次进行荧光观测前，必须例行检查荧光装置的灯丝对中、光路对焦、孔径光阑、视场光阑设置等状况。

　　(2)所需要的荧光激发/发射滤光片组件是否已装在转换器中，物镜配置是否得当，除去物镜前透镜的油渍和灰尘。

　　(3)如同时进行透射光相差观察，要检查聚光镜对中心及相差环与物镜相反的共轭情况。

　　(4)检查样品载体(载玻片、盖玻片和其他器皿)有否挂有液体、灰尘，厚度是否在物镜标定的工作距离范围内。切片样品不能太厚，约≤10μm为宜。

　　(5)因照明光源含有紫外线，在载物台前上方放一块棕色遮光板，以防紫外线损伤视网膜。

　　(6)电压不稳会降低高压汞灯的使用寿命，光源电源最好加配稳压器。

　　(7)为延长汞灯寿命，在开启后15min方可关闭；汞灯荧光电源一旦关闭，再次启动至少需等待10min，以使水银蒸汽冷却复至原态，否则会影响灯的寿命。

　　2)荧光镜像观察

　　(1)在开启荧光灯源后约5～10min激发光强度趋于稳定，装载样品进行观察；为防止在调焦和寻找物像过程中过度激发光照会造成样品荧光淬灭，最好先通过缩小荧光照明器的孔径光阑或加ND滤光片将激发光调节到适度强度，有规律地移动样品台，待确定镜像后，在调节到最佳荧光状态用于拍摄记录。

　　(2)镜像质量不佳的调整。排除样品制备因素外，可进行的必要调节措施是：

　　①排除成像光路中的遮光或限光器件，如DIC附件、ND滤光片等。

　　②重新调节荧光照明器的收光器对焦和孔径光阑大小。

　　③细心调节物镜覆盖差校正环。

　　④复查荧光激发/发射组件是否与所标记的荧光色素对应。

　　(3)在不影响分辨率的前提下，于照相取景框和CCD靶面范围之外，可尽量回缩荧光光路视场光阑和物镜(100X物镜)的数值孔径光阑调节环，以避免杂散光的影响、提高景深，并可减小激发面积防止附加样品淬灭。

　　(4)暂时不观察时，应阻断激发光路。

　　(5)油镜观察时，须用“无荧光油”，尤其是在U、V激发时，因常规镜检用的香柏油带有青色荧光。

　　3)荧光照相和数字CCD相机图像采集

　　(1)荧光照相

　　①尽管肉眼观察荧光镜像亮度与普通明场相差无几，而实际上曝光时间要增加数倍甚至几十倍，应使用快速感光胶片，如ISO200(24DIN)、ISO400(27DIN)。

　　②根据荧光物像在测光区的分布比例和镜像的明暗程度设置曝光补偿调节，原则上适当增补偿，以获得背景黑暗荧光图像明亮、鲜艳的照片效果。

　　③如果没有照明标线取景器，可先选择较明亮的荧光区域进行对焦调整。

　　④对点状荧光物像或扑捉某点为主的拍摄，可选择适当的点测光模式。

　　⑤对在同一幅需要同样条件拍摄的分散点状荧光物像，可试用点测光配合自动锁定方式拍摄。

　　⑥曝光过程应避免任何振动，有条件可配置防震台。

　　(2)数字CCD相机图像采集①光学接口的中间倍率要与CCD的芯片尺寸合理匹配。

　　②采用合适的荧光拍摄模式，摸索减背景(Background Subtraction)处理条件，根据镜像情况设置Binning、Gain、Gamma等参数。

　　③因CCD芯片灵敏度较高，如果荧光镜像过于明亮，为获取对比度较好的采集图像，可适当缩小荧光照明器孔径光阑或加ND滤光片，特别是在荧光辉光较强影响拍摄样品细节的情况时。

　　实际工作中，为获得较好的荧光图像拍摄质量需要对上述调节机制的综合运用，反复摸索、优化条件。