蛋白质荧光光谱研究的一些新方法

1. 同步荧光光谱
同步荧光技术是在同时扫描激发和发射波长的情况下来测绘荧光光谱图。由测得的荧光强度信号对发射或激发波长作图，即为同步荧光光谱。它包括固定波长的同步荧光和固定能量的同步荧光两种光谱。固定波长的同步荧光光谱首先由Lloyd[8]提出，固定能量的同步荧光光谱则随后由Imman[9]等人提出。 1) 固定波长的同步荧光光谱
在同步扫描中，使激发波长和发射波长保持固定的波长间距，即在$K= Kem - Kex= 常数的情况下进行扫描，以同步荧光信号(相对强度) 对发射或激发波长测绘荧光光谱图，则为固定波长的同步荧光光谱。在同步扫描的荧光测定中，同步荧光信号强度I s是激发波长的函数，其基本公式为[10]:
I s (Kex ,Kem ) = K cbEx (Kex ) EM (Kem ) (1)
式中，c为待测物质的质量浓度，b为试样溶液的厚度，K为实验条件下某常数，E x为激发光谱的强度分布，EM为发射光谱的强度分布。由(1) 式可知，在实验条件保持固定的情况下，测试物质的同步荧光信号强度与待测物质的质量浓度成正比。这是定量分析的依据。在利用同步荧光测试样品前，$K值必须慎重选择，只有当$K恰好为某吸收带和其发射带之间的波长间距时，才能观察到同步信号。2) 固定能量的同步荧光光谱
固定能量的同步荧光光谱是指在同步扫描过程中，使激发波长与发射波长之间保持着固定的能量差，即使得$M= (1ö Kex - 1ö Kem ) ×107为常数，$M表示波数差(cm - 1)。固定能量的同步荧光法与固定波长的同步荧光法相比较，后者能消除瑞利散射，但是不能消除拉曼散射，反而使拉曼散射加宽。固定能量的同步荧光法既能消除瑞利散射，又可消除拉曼散射，这有利于分析方法灵敏度和精密度的提高，故一般选用前一种方法。如前所述，在构成蛋白质的20 种氨基酸中，仅有芳香族氨基酸Trp、Tyr、Phe是发荧光的基团，但由于三者在普通荧光光谱中的激发光谱和发射光谱相互重叠，不能同时测定，给研究蛋白质的工作带来了困难，1979年Miller[11]用同步荧光光谱法分别获得了Trp和Tyr的特征光谱。到目前为止，应用同步荧光光谱技术研究蛋白质的报道还比较有限。Rao率先研究了眼晶体蛋白(crystallin)的荧光光谱，在$K= 30nm条件下A、B、C2眼晶体蛋白的同步荧光光谱可以清楚地分开，可以提供特定的信号信息[12]。Chou等研究了细胞色素C溶液的同步荧光光谱，发现细胞色C分子中的Trp和Tyr残基的同步荧光光谱可采用不同的波长差来分开，细胞色素C溶液的同步荧光光谱随溶液pH不同而变化反映了pH诱导的细胞色素C构象变化[13]。 2. 三维荧光光谱法
三维荧光光谱法是20年前提出的一种荧光分析新方法。特别是最近提出的三维荧光偏振光谱在研究溶液中荧光物质分子的行为特征方面具有较大的优越性。三维荧光光谱是由激发波长(Y 轴) 2发射波长(X 轴) 2荧光强度(Z 轴) 三维坐标所表征的矩阵光谱(excitation2em ission2matrix spectra)，也叫总发光光谱(total luminescence spectra)，显然该技术可获得激发波长(Kex) 与发射波长(Ke) 同时变化时的荧光强度信息。三维荧光光谱图的表示方式有三种，即三维投影图( isometric projection)、激发发射矩阵(EEM ) 以及等高线(contour plot) 荧光光谱图[14]。用三维投影方式表示的荧光光谱，比较直观，较容易从图上观察到荧光峰的位置和高度以及光谱的某些特性。三维荧光光谱图，由于比二维的平面图多了一个坐标，所得的总荧光数据又比普通荧光光谱多得多，故其具有高选择性。10余年前，三维荧光光谱法开始应用于生物医药领域[14]。最近，鄢远等人首次将三维荧光光谱法用于测定溶液状态下蛋白质的构象[15]。结果表明:三维荧光光谱法是一种研究蛋白质溶液构象的很有效的分析方法。该方法能够较直观地表明Trp残基在蛋白质分子中的微环境及其在不同条件下的构象变化，因而可望得到广泛的应用。Chen等利用三维荧光光谱法研究了A aH¸ 在不同介质中的构象变化[16]。用EDTA 脱去A aH ¸中的金属离子后，尽管Stoke位移保持不变，用等高线表示的apo2A aH, 的三维荧光光谱发生了显著的变化，同时apo2A aH¸的荧光强度降至只有天然A aH¸的26%，结合其它实验结果证明了A aH¸中的金属离子对于保持活性和维持其构象稳定都具有重要作用。总之，荧光光谱法是研究溶液中蛋白质分子构象的一种有效的方法，其测定条件更接近生命体的生理环境, 因而在蛋白质乃及生命科学研究中具有重要意义。 3. 荧光共振能量传递分析
荧光共振能量转换(fluorescence resonance energytransfer, FRET) 是指两个荧光受色基团足够近时，供体分子吸收一定频率的光子后，被激发到更高的电子态，在回到基态前，通过偶极子相互作用实现能量向邻近的受体分子转移。FRET由两部分组成:镧系元素螯和物为能量供体，有机探针为受体。FRET是进行结合分析(抗体2抗原;受体2配体,肽2蛋白或蛋白2 蛋白激酶分析)的理想工具。此中分析基于两种标记：能量供给长时间衰减螯和物标记；短时间衰减有机接受体。当标记物被带到非常接近结合反应时能量转移发生。根据记录接收体的时间分辨荧光量来检测转移的能量。