东曹：生物医药领域的分离专家

　　【导语】生物医药是二十一世纪发展前景最诱人的一个产业，无论是全球的市场规模、跨国药企在中国的投入，还是中国相关的CRO外包产业、“十二五“规划的预期和投入，都在迅猛地增长。生物医药产业链条中的几乎每一步都离不开分离纯化，而色谱柱、填料和层析介质无疑是其中重要的工具。本文将主要介绍东曹（TOSOH）公司提供的生物医药分离纯化方案，对于在生物医药领域工作的、关注效率和成本的读者们，希望此文给您带来帮助……

　　生物医药领域客户的需求 & 东曹产品的特点

　　谈到生物医药领域的分离纯化，虽然有液液分离、超临界流体分离等方法，但大部分方法还是建立在固液分离的填料化学基础上，尤其是对于大分子药物。这时人们至少会有如下几点考虑：

（1）分离的对象是什么，比如：蛋白/多肽，寡糖/多糖，DNA/核酸，生物高聚物，抗体，抗生素，药典包括的各种化合物等等。

（2）分离的目的是什么，是为了质控检测，还是为了制备纯化。对于客户来说，制药企业在初期工艺开发、工艺过程控制中用到的是HPLC 色谱柱，而在工业规模的生产阶段用到的是层析填料，到产品品质管理时用到的又是HPLC色谱柱，进入市场后监管机构（如FDA/SFDA）用到的也多是 HPLC色谱柱。

（3）使用哪种分离原理，除了常见的分辨率较高的反相（RPC）、正相（NPC）外，还要考虑能保持更高生物活性的尺寸排阻（SEC）、离子交换（IEC）、疏水作用（HIC），选择性最专一的亲和作用（AFC）分离等。

（4）如果有多个供应商，要综合比较产品性能、客户口碑、方法转换成本、售后服务、到货期、购买价格…….

　　中国和世界上许多国家一样，开展该领域工作的客户首先是购置仪器（比如HPLC或层析系统），然后再购买HPLC色谱柱或层析填料。因此在早期，客户们采购分离纯化的色谱柱/填料产品时，最先接触到的是仪器公司提供的方案。仪器公司为了集中精力和优势，一般会考虑发展跟自己仪器配套的分离纯化产品来提供整合方案；从历史上看，生产制造HPLC和层析系统的著名仪器公司是不同的，客户很难从一家公司那里，同时购买到合适的HPLC色谱柱到层析填料。但其实，填料化学本身并没有歧视或偏见，不管是HPLC色谱柱还是层析填料，都建立在硅胶或是聚合物两大基质基础上。

　　随着生物医药产业的发展，一些原来从事诸如化工、材料等行业的公司进入了生物医药的分离纯化领域；显然对于这些公司来说，它们要想参与真正的竞争，要充分考虑本文开篇谈到的客户的各种需求，同时让自己的产品兼容于客户手边已有的仪器。（当然，在一些仪器竞争不是非常充分的市场上，它们也会发展自己的仪器，比如离子色谱、GPC凝胶色谱等）。对于客户来讲，一定要关注这样的公司，因为，卖方的竞争一定会使自己获益。

　

　　东曹（上海）生物科技有限公司副总经理 潘明祥先生

　　东曹生命科学（Tosoh Bioscience）是其中非常重要的一个竞争者。东曹生命科学事业部（Tosoh Bioscience）成立于1970年，是东曹株式会社（成立于1935年）的8个事业部之一，1972年因首次将H型聚合物色谱柱用于有机可溶性聚合物的分析而闻名全球，现已成为液相色谱柱、层析介质和临床诊断系统的全球领先供应商。在中国，东曹于2004年首先在上海成立了生命科学部门，然后于 2010年正式成立东曹（上海）生物科技有限公司（Tosoh（Shanghai）Bioscience Co., Ltd.）。据东曹（上海）生物科技有限公司副总经理 潘明祥 先生介绍，东曹的生物医药分离产品有如下特色：

　　（1）主要定位于生物大分子的分离分析应用

　　“尽管我们也有很多产品可以应用于低分子化合物的分离分析，但生物大分子的分离分析应用，一直是东曹生命科学部 TSK-GEL 色谱柱、TOYOPEARL 中低压/TSK-GEL 中高压层析填料研发、生产和销售的不变目的。几十年来，我们没有盲目追求产品链的过度扩张，瞄准的一直是各领域中的高端客户和市场。”

　　（2）产品质量稳定可靠：使用机器人自动填装液相色谱柱

　　“东曹公司是全球为数不多的使用机器人进行液相色谱柱自动装填的厂家之一。无论是产品的研发还是生产，公司每年都会投入大量的资金，对产品进行不断的改造、创新甚至革新，并不懈地努力降低客户对产品质量的投诉率。举例来讲，由于产品质量的稳定，TSK-GEL SW 和 SW_XL 系列色谱柱几乎成了全球进行蛋白分析的黄金标准。GPC 凝胶渗透色谱仪以其专业、性能稳定，已连续多年占有日本 70%以上的市场份额。 ”

　　（3）从分析到工业规模制备产品的连续性：方便工艺放大，降低开发风险

　　“对于生物医药企业来讲，HPLC 色谱柱主要用于初期的工艺开发、工艺过程控制及产品品质管理，中低压、中高压、高压层析填料主要用于生物药品的工业规模的分离和纯化。东曹公司是世界上为数不多的可以提供从粒径只有几个微米的 HPLC 分析柱，到粒径为 20、30 微米的高压、中高压层析填料，再到粒径为 35、65、100、200、300 微米的中低压层析填料，而保持填料基质不变的厂家之一。这种无缝的产品链接，在一定程度上不仅方便了科研人员进行工艺放大实验，更是大大降低了产品开发的投入风险。” 这就意味着，客户可以从东曹一家，获得从色谱柱到层析介质、从分析到制备的、同一种填料基质的产品。

　　（4）先进和不断创新的技术

　　“从第一根用于高分子分子量分析测定的 GPC 色谱柱的问世以来，我司在液相色谱领域的研发和生产经验已达 40 年之久。除了重视产品质量的以外，我们一直没有停止过新技术的开发和应用、产品的更新换代和创新（本文后面有详细介绍）。”

　　接下来，让我们从多个角度、代表性产品等方面继续了解东曹的解决方案。　

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全面的、针对生物医药分离纯化的解决方案

　　如本文前面所述，处于生物医药的研发、生产、质控、监管等各环节的客户有不同的要求。东曹专注于该领域40余年，提供了非常全面的分离纯化解决方案。

　　东曹拥有种类齐全的TSK-GEL系列色谱柱，包括：尺寸排阻（SEC）、离子交换（IEC）、疏水作用（HIC）、亲和作用（AFC）、反相（RPC）和正相/亲水（NPC/HILIC）色谱柱；还拥有丰富的TOYOPEARL层析填料，包括：离子交换层析（IEC）、疏水层析（HIC）、亲和层析（AFC）、尺寸排阻层析（SEC）填料。

　 　可以说，在生物医药分离纯化领域，不管您是分离较小分子量的氨基酸、寡糖、核酸、多肽，还是分离高达几百万分子量的蛋白、DNA、多糖、生物高聚物；不 管您是用于质控检测还是用于工业规模的制备纯化；不管您的要求是高分辨率的分析，还是保持生物活性的分离，甚至是具有超高选择性/特异性的亲和纯化分离， 东曹几乎都能满足您的需求。

　　

　　生物分离用TSK-GEL HPLC色谱柱

拳头产品：尺寸排阻色谱（SEC）

　 　东曹是全球分子尺寸排阻色谱（SEC）产品的先驱和领导者，或者不如说，提到尺寸排阻色谱，就一定要提到东曹。1972年，Tosoh首次将H型聚合物 色谱柱用于有机可溶性聚合物的分析。1978年，Tosoh开发出PW型系列柱，实施水溶性聚合物的凝胶过滤分析。1977年，Tosoh推出SW型凝胶 过滤柱，成为高性能凝胶过滤柱产品的创造先驱，更在生物科技等新兴领域中成为蛋白质分子量分析的代名词。

　　持续的研发和创新使东曹拥有全球最为丰富、性能最高、口碑最好的尺寸排阻色谱产品线。目前，东曹不仅拥有水溶性高分析测定用的 SW/SW_XL、PW/PWXL 系列 GFC 色谱柱，油溶性高分析测定用的 Hxl/Hhr 系列 GPC 色谱柱，更是拥有水相、有机相两用的 AW 系列色谱柱。不仅具有常规粒径、常规尺寸的 SEC 色谱柱，更是拥有粒径更小、色谱柱尺寸更小的 SuperSW、SuperH、SuperHZ、SuperAW 系列微量色谱分析柱。这两年更是推出了单一粒径、孔径多分散型 Multipore、SuperMultipore 系列油溶性 H、水溶性PW 的色谱柱。（注：东曹尺寸排阻柱，一般加XL下标的为第二代产品，加Super的为第三代产品，从第一代到第三代，粒径减少，速度加快）。

　　TSK-GEL SW型色谱柱：蛋白分析的黄金标准

　　与其他竞争产品比较，TSK-GEL SW型色谱柱单位柱体积的孔隙容量更大，能产生更高的分子量选择性范围和更高的分辨率，几乎成为全球进行蛋白分析的黄金标准。比如G3000SW_XL对单抗的单体和多聚体分析非常有效，在抗体纯化工艺中，可用于抗体产品纯度的过程控制和最终的纯度确认。由于进样量小，流动相等较为简单，因而操作十分简便。 G3000SW_XL几乎成为全球抗体生产或研发公司进行单体和多聚体检测的黄金标准色谱柱。

抗体片段(Fab)的制备：鼠单抗(IgG1)经木瓜蛋白酶水解后的Fab 制备及其随时间变化的TSKgel G3000SW_XL的分析监测

　　β-内酰胺类（头孢类/西林类）抗生素的分析：聚合物含量检测

　 　 β-内酰胺类抗生素是临床上常用的药物之一，其在临床上最常见的不良反应是速发型过敏反应。研究成果揭示，引发β-内酰胺类抗生素速发型过敏反应的过敏原 不是β-内酰胺类抗生素本身，而是其中存在的高分子聚合物。因此，药典对该类药品中的高分子聚合物含量有严格的要求。目前，该类药品中高分子聚合物的分析 方法主要采用的是凝胶色谱法。在2011版《中国药典》中规定了β-内酰胺类抗生素需要进行高分子聚合物的含量检测，均采用的是凝胶色谱法。通过使用的填 料是葡聚糖，装填到内径1.0~1.4cm、柱长30-40cm的中低压色谱柱进行分离检测。但在实际应用中，发现这种方法有一些问题，如：柱效低、不同 人装填重复性不好、峰形拖尾、分析时间较长等。最近，也有一些国内厂家采用高效液相色谱柱的装填工艺进行方法改进，但由于填料自身的原因，无法装填出柱效 过万的色谱柱，而难以满足药物分子、高分子聚合物及不同聚合度高分子聚合物之间分离的需要。而东曹的TSK-GEL高效凝胶色谱柱可以较好地解决这一问 题，并提供了数据集。

　　对于水溶性的β-内酰胺类抗生素比如：头孢克洛、头孢丙烯、头孢地嗪钠、头孢噻吩钠、哌拉西林钠、头孢米诺钠、注 射用头孢他啶、注射用头孢唑林钠、注射用头孢哌酮钠、头孢拉定胶囊、头孢硫脒、头孢地尼、注射用头孢美唑钠、注射用头孢曲松钠、注射用盐酸头孢吡肟、注射 用盐酸头孢替安、阿莫西林胶囊，用G2000SW_XL或G250SW_XL可很好分离检测。对于油溶性β-内酰胺类抗生素比如：盐酸头孢卡品酯、头孢呋辛酯、头孢泊肟酯、头孢特仑新戊酯、头孢克肟，用G2500H_HR或G2500H_HR可很好分离检测。

　　更多请见：

　　β-内酰胺类抗生素分析应用文集

　　TSK-GELSEC色谱柱的选择指南

【小知识】

　 　尺寸排阻色谱法（SEC）根据填料孔隙而辨别个体样品成分，是聚合物分离的主要方法。样品大分子不能进入或只能进入部分孔隙，而较小分子则能进入全部或 多数孔隙。在SEC中，大分子先从柱中洗脱出来，小分子后洗脱出来，能够进入所有孔隙的最小分子最后从柱中洗脱出来。尺寸排阻色谱法是唯一不会通过溶质与 固定相之间吸附作用或分配作用的色谱法。术语SEC、GFC（凝胶过滤色谱法）和GPC（凝胶渗透色谱法）均指相同的色谱技术。GFC使用含水流动相，而 GPC则使用有机流动相，通用术语SEC包括上述两种用途。

　　生物化学家喜欢采用GFC分离蛋白组分或去除生物技术生产过程中最终的聚合物。GFC还常被用于除去（蛋白质）样品溶液中的盐分，为其它色谱分离模式制备洗脱样品。GPC在工业有机可溶聚合物的检定过程中发挥着重要作用。

　　生物大分子的分离分析中，东曹还有离子交换、疏水作用、亲和作用等色谱柱；对于低分子量的药物，其反相和正相/亲水作用色谱柱也应用广泛。参考请见：

　　东 曹生 命 科 学 事业部门TSK-GEL色谱柱产品介绍

　　TSK-GEL色谱柱在生物大分子分离分析中的应用数据集

　　TSK-GEL反相色谱柱的选择指南

　　高性能离子交换柱TSKgel STAT系列色谱柱分离报告

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综合应用TSKgel多种分离原理的产品

　　单克隆抗体分析全攻略：SEC、IEX、HIC、AFC色谱柱

　　在单克隆抗体分析中，前面介绍过，首先会考虑操作简单的SEC色谱柱（比如G3000SW_XL），但其不可分离空间尺寸大小相近的抗体异构体（空间异构、电荷异构等），这时可考虑用离子交换（IEX）色谱，IEX 进样量比SEC大，但可进行梯度洗脱和细致分离纯化。东曹提供了多种 IEX色谱柱，比如：可用阳离子交换色谱柱（如CM-STAT）进行抗体异构体的检测；用阳离子交换色谱柱（如SP-STAT）进行单抗PEG修饰过程中 的过程控制或最终产品分析；用阴离子交换色谱柱（如Q-STAT）进行单抗糖基化差异分析；用NPR系列色谱柱（如SP-STAT）进行样品量极少、追求 高选择性、高分辨率的分析。

　　其中，单抗糖基化差异分析，是目前基因工程药物分析中的一大挑战，也是非常具有市场前景的一大分析领域。因 为蛋白糖基化现象普遍存在，糖基化的差异（糖链长短、糖键和位点等）会影响蛋白的功能；而目前，上游表达对糖基化差异不可控，糖基化的定性/定量分析方法 非常有限，东曹正在和客户合作开发方法。

　　疏水作用（HIC）也 可对SEC、IEX无法完成的分析起到很好的补充作用（如对空间尺寸、带电状况相近的异构体进行分析），HIC也可进行梯度洗脱和细致分离纯化。东曹的 HIC色谱柱系列很丰富，如样品量较少可用NPR系列的疏水色谱柱；对于疏水性很强的抗体样品，可用Ether类分析柱获得很好的样品回收率，因为这类抗 体用SEC/IEX/AF模式时吸附很强，样品回收率低。

　　亲和作用（AFC）分 离中，ProteinA、ProteinG（或客户自制的使用特定抗原为配体的亲和柱等）与抗体具有很好的生物特异选择性，非常有效，但成本最昂贵，不被 普遍使用。东曹也提供亲和作用色谱分析柱的定制服务，比如研发初期，在上游进行表达后，检测发酵液中是否有抗体被表达出来，表达量到底有多大。虽然，它也 可被G3000SW_XL色谱柱代替。

　　前文中曾介绍，从分析用的HPLC色谱柱，到工业规模的制备产品（高压、中高压、中低压层析填料），东曹的产品保持填料基质不变，这种无缝的产品链接，为客户带来极大的好处，方便科研人员进行工艺放大实验，并大大降低产品开发的投入风险。

　　去除疫苗中的内毒素：离子交换、疏水填料

　　疫苗生产中要求必须去除内毒素，内毒素的主成分分子量很大，就像蛋白质，其分子量分布很广，带负电荷，疏水性很高。对于阴离子交换及疏水填料，内毒素可以有很好的吸附，可利用这种吸附性来达到分离。

　 　比如使用东曹的阴离子交换填料DEAE-650M，Q-600C AR，GigaCapQ-650M，由于内毒素吸附作用非常强，一般实验完成后，最后会用1-2mol/L Nacl来洗脱。所以还可以使用东曹的SP-650M等阳离子交换填料，内毒素因为无法吸附，会通过柱子直接流出，效果会更加明显。另外用东曹的疏水填料 Butyl-650M，Hexyl-650C也可去除疫苗中的内毒素。

耐碱型、高载量、高流速：TOYOPEARL AF-rProtein A-650F层析介质

　 　近年来，单克隆抗体药物的研发和生产正在迅猛增长。自1986年强生公司推出第一个单克隆抗体药物后，到2009年已有27个单克隆抗体药物被美国 FDA批准上市（注：目前化学药被 FDA批准的几乎没有，单克隆抗体药物已占FDA批准的生物药的3/4左右），2008年全球销售额超过300亿美元。国内单克隆抗体发展势头迅猛，目前 已有上百家公司和研发机构进入单克隆抗体研发和生产，并取得自主研发的多个品种（注：对比化学药，我国几乎没有自主研发的品种）。

　　在单 抗生产的下游纯化中，Protein A亲和介质是已被证明最有效的层析介质，比如在采集上游产物后，可通过Protein A亲和介质，单抗分子可与Protein A专一性结合，从而除掉> 98%的CHOP、病毒、DNA和有机分子污染物。但从载量上看，Protein A不及阳离子交换层析，而在酸性低pH值下的洗脱容易导致单抗多聚体的增加(HMW)，还需要在后续步骤中去除脱落的Protein A配体，另外，Protein A亲和介质也是极其昂贵的，比如新一代耐碱型/高流速的售价大概为每升15,000美元。

　　东曹最近推出新一代耐碱型、高载量、高流速的Protein A层析介质——TOYOPEARL AF-rProtein A-650F，具有如下优点：

　　（1）耐碱/良好的化学稳定性：对NaOH、其它的变性剂(如盐酸胍、尿素）以及有机溶剂(如乙醇)稳定，可以很方便地进行填料的清洗，可以在室温条件下保存该填料。

　　（2）高载量：在1分钟的柱留时间(Residence Time)下载量比同类产品高出30%，高浓度单抗料液(10g/L)进样时载量比同类产品高出20%。

　　（3）同样适用大型层析制备柱的装填：良好的层析介质刚性，确保填料可以用于高流速下而不发生柱床塌陷；更易装填至数百升的大型层析制备柱，用于目标样品的捕获。

　　（4）降低了填料使用成本：无论对工艺初期筛选用小包装，还是生产用大包装，都提供了更有竞争力的价格。

　　参考请见：Toyopearl AF-rProtein A-650F层析介质的介绍

东曹在中国：加强服务、沟通、应用

　　东曹公司在中国市场起步虽晚，但在中国市场的投入相当可观。东曹的领导层深知液相色谱产品除销售外的配套技术支持和服务的重要性，于2010年成立了新的东曹（上海）生物科技有限公司，设立技术服务中心，东曹为更好地服务于中国国内客户的决心可见一斑。

　 　同大多数进入中国市场的色谱柱生产厂家一样，东曹（上海）生物科技公司也是采取总代理/代理方式销售、直接销售、以及多种方式并存的销售模式。但东曹同 样注重为客户或代理提供更为准确、迅速的售前和售后服务及市场推广工作。更为重要的是，东曹不断加强与部分国家职能机构或部门、大学及科研院校的共同研究 活动。所有这些，使得东曹与中国用户的沟通越来越紧密。

　　新的东曹（上海）生物科技有限公司除了销售和市场部门，更重要的是加大了技术服 务部门的投入。目前的技术服务中心拥有三个独立的实验室，分别服务于TSK-GEL高效液相色谱柱、TOYOPEARL层析填料、凝胶渗透色谱仪/离子色 谱仪用户。所有技术人员均拥有硕士以上的分析化学、或生物技术类专业学位。技术服务中心总负责人也是由日本总部具有二十多年液相色谱产品开发经验的技术专 家担任。技术服务中心会进一步加强热门应用开发、客户委托分析及纯化工艺开发、科研合作、定期培训及技术研讨会、其他售前和售后服务的功能。

液相色谱及层析方法未来的发展趋势　　

　　最后，潘明祥先生应笔者要求，谈到液相色谱及层析方法未来的发展趋势，他表示：

　 　“作为分离纯化的手段之一，液相色谱（层析）方法目前还是相当先进的。曾经有人提到，只要是可以溶解的样品，无论组分多么复杂，通过液相色谱（层析）法 一定可以实现任何两个不同组分的分离。当然，现实中无论是科研工作者还是生产企业不可以不关心成本和投入。因此，液相色谱分析或制备的一般原则是：利用两 个或多个组分间的最大差异、尽可能使用最少最经济的步骤或工艺实现分离纯化目的。围绕这样的目的，我想将来的液相色谱（层析）的发展趋势也许有几点值得思 考。

　　（1）分辨率：液相色谱分析柱或制备柱的分辨率除了与柱长、流速、洗脱梯度、温度、外围系统等诸多因素有关外，最本质的决定因素还是柱内填料本身。一方面，填料粒径越小，相对分辨率也越高。因此，小粒径或超小粒径填料的开发和研究仍是方兴未艾。如果能很好地解决粒径与柱压等平衡制约等问题，这必将为复杂体系组分的研究工作提供更为有效的手段。另一方面，利用越来越先进的化学键合技术，使得多模式混合型填料的使用成为可能，这为一些原本难以通过单模式进行分离纯化的工作提供了新的方便。将来，如果能够随时获得或生产出具有化学或生物特异反应的任意亲和填料，必将为生物标记物探索与发现工作带来很大的便利，可以方便、经济地获得任意需要的目标组分。另外，近些年来还出现了很多对温度或某个因素敏感的色谱填料，虽然目前应用还比较局限，但也为分析或制备某些特殊样品提供了思路和可能。

　　（2）生产效率和成本：液 相色谱分析法也许更多的还是考虑分辨率，但工业规模的制备色谱我想更多需要关心整个生产工艺的成本。层析工艺的成本占整个生产上下游工艺的比例已经是举足 轻重了。除了需要具备分离选择性高、分辨率高之外，未来的填料应该同时具备更高载量、可以在更高流速下使用、耐压且压降足够低、化学稳定性更好（如：耐碱 耐酸性等）、填料使用寿命更长、单位工艺过程更为快速（如：洗脱峰形尖锐、清洗再生容易等）、价格相对低廉等特点。

　　总之，对于从事液 相色谱技术研究的科研人员或专业供应商们来讲，同时具备快速（如：高通量）、准确（如：高分辨率）、使用方便（如：技术门槛低、外围设备投入限制少等）、 投入成本低（如：使用寿命长、高载量、耐高流速等）的液相色谱（层析）分离纯化介质产品的研发，仍然会是将来一段时间的目标和课题。”

如您感兴趣，请在此咨询：

联 系 人：郝佳越
电子信箱：haojiayue@tosoh.com.cn

关于东曹生命科学（Tosoh Bioscience）：

　 　东曹株式会社成立于1935年，是石油化工、无机化工、精细化工、电子材料和医疗诊断等产品的全球供应商， 客户涉及化工、半导体、制药、保健、食品以及其它众多行业。东曹集团由140多家子公司及关联公司组成，全球拥有不同国籍的员工10,000多 人，2008年集团销售额超过77亿美元。

　　成立于1970年的东曹生命科学事业部（Tosoh Bioscience）东曹8大事业部之一。东曹生命科学是液相色谱柱、层析介质和临床诊断系统的全球领先供应商，采用完全自有的生物分离和诊断组合技 术，为医疗和科学研究提供优质的产品和服务，全球员工约为300人，年销售额近3亿美元。东曹生命科学还研发生产分析仪器，如离子色谱仪、GPC凝胶色谱 仪。

　　东曹于2004 年设立了东曹达（上海）贸易有限公司生命科学部门，开始了中国市场的开拓和服务；2010 年 7 月，该部门宣布独立，东曹（上海）生物科技有限公司（Tosoh（Shanghai）Bioscience Co., Ltd.）正式成立。

　　了解更多信息，请访问：http://www.separations.asia.tosohbioscience.com/