质谱沙龙第三十四期活动报道

　　2011年12月4日，第三十四期质谱沙龙活动在第二炮兵总医院药学部成功举行。本次沙龙探讨了质谱技术在临床药物监测（TDM）和食品中过敏原物质检测方面的应用，并有华质泰科（ASPEC）公司首席技术官刘春胜博士为大家带来了国际前沿的液滴萃取表面分析（LESA）技术及其应用。来自第二炮兵总医院、北京安定医院、中科院高能所、中国计量科学研究院、中国环境科学研究院、北京师范大学医院、AB SCIEX公司、华质泰科生物技术（北京）有限公司、北京艾米诺医学研究有限公司等，二十余位专家、学者、技术工程师参加了本次沙龙活动。

第三十四期质谱沙龙活动现场

第三十四期质谱沙龙活动现场

质谱检测技术在临床治疗药物监测（TDM）中的实际应用

　　第二炮兵总医院李鹏飞老师作了题为《质谱检测技术在临床治疗药物监测（TDM）中的实际应用》的报告，介绍了临床治疗药物监测（TDM）的概念方法，他克莫司及试剂盒开发、环孢素TDM工作、免疫抑制剂及其合并用药、以及中毒检测和内源性小分子等相关研究工作，并简要介绍了所在实验室的质谱检测平台、科研工作和科研活动。

第二炮兵总医院 李鹏飞 老师

　　治疗药物监测（TDM）介绍

　　治疗药物监测（“血液浓度监测”TDM）是对治疗指数窄、毒性作用强、个体差异大的药物，测定其血液或其他体液中的药物浓度，根据药动力学原理制定个体给药方案。按照“医院管理评价标准”的规定，医院应当开展治疗药物监测，推广个体化给药方案。传统的治疗方法是参照教科书上推荐的平均剂量给药，其结果是仅一些患者得到有效治疗，另一些则未能达到预期的疗效，甚至出现了毒性反应。TDM药物具有明显的特点：安全范围窄，治疗浓度范围与中毒浓度很接近，如地高辛；无明显的、可观察的治疗终点或指标，无及时的、易观察的、可预知疗效的临床指标，如抗癫痫药物；剂量、药物作用之间的关系不可知，同一剂量，不同患者可出现有效、无效、中毒等不同反应，如苯妥英钠；药物中毒与无效时均危险，如抗排异药物；药物血液浓度与临床作用、中毒之间有一个较好的关系。目前临床主要监测的品种有庆大霉素、万古霉素、环孢霉素A、卡马西平、地高辛、丙吡胺等。

　　国内治疗药物监测主要光谱法、免疫法、色谱法等。光谱法一般有比色法、紫外分光光度法、荧光法等，灵敏度比较低，只能监测体液中药物浓度在1.0µg/mL以上，并且代谢物或结构相近化合物对监测的干扰较大，该法基本淘汰。免疫法利用蛋白竞争的原理进行监测，放射免疫法、酶免疫法、荧光免疫法、均相酶免疫法等，方法样品处理简单，获取结果时间较短，已成为临床用于评判疗效的一个重要依据，是国内临床通用方法。色谱法有HPLC法、气相色谱、高效毛细管电泳法、LC-MS法等，具有高通量、高灵敏度、高特异性等特点，检测值更接近真实值，国外广泛使用。LC-MS/MS进行TDM具有快速、多组分同时测定，专属性强、灵敏性和准确度高、重现性好，性价比高等优势。患者能够获得安全有效的治疗，达到器官移植的最终目标，降低急性排斥反应发生率和感染风险，而且检测及药品费用降低;医生可以得到准确的检测结果，做出高效安全的治疗方案，提高了病床周转；医保部门也可以多方位节约成本，如检测费用和治疗费用；医院也可节省医疗资源，增加学术和经济收益，提升市场竞争力。

　　李老师对TDM市场作了简要分析，以监测他克莫司为例。全国约有1.5万移植患者，每例移植患者每年监测20次，监测市场9000万元，LC-MS占市场的1/5，约2000万元。快速、准确的治疗药物监测结果是“以病人为中心”临床个体化工作的需要，也是提升医药水平市场竞争力的需求。随着分析技术的不断发展，LC-MS/MS法将逐渐取代免疫分析技术成为TDM的常规方法。它的低成本、高准确度将是患者以及医疗人员的福音。

　　相关研究工作

　　他克莫司监测起源于生物等效性试验研究，由于免疫法检测费用高、灵敏度低，而且血药浓度个体差异大，所以李老师采用了液质联用技术，并于2007年申请了《药物代谢酶基因多态性和LC-MS/MS技术联合指导他克莫司个体化给药临床应用》的课题，得到了首都医学发展基金的支持，该课题建立了LC-MS/MS方法监测血液浓度，研究了基因多态性。液质参数如下表，样品前处理流程见下图。

色谱柱	Shim-pack VP-ODS柱
流动相	乙腈-10mmol·L-1乙酸铵梯度洗脱
流速	1.0mL·min-1
柱温	50℃
进样量	20µL
离子源	离子喷雾离子化源（ESI）正离子方式检测
扫描方式	多重反应监测（MRM）
DP电压	60V
CE电压	21eV

样品前处理流程

　　李老师采用LC-MS/MS法测定他克莫司，考察了其专属性、准确度、精密度、线性和定量限结果，相对标准误差在10%以内，线性范围为0.5-50ng/mL（MEIA法1-30ng/mL），相关系数都接近3个9，检测限为0.05ng/mL，灵敏度高，线性好。另外，李老师考察了LC-MS/MS法与MEIA法测定肝移植患者全血样品结果，共8个试验批次，800多个样本，得到了很好的相关性，而后又做了9个试验批次。对74例健康者进行分析，FK506的主要代谢酶是细胞色素CYP3A5，中国人群的基因背景与白种人和黑人有很大的差异。该方法是创新的检测方法，用于他克莫司的LC-MS/MS法检测试剂盒是SFDA第一个批准的，是全国第二个获批的LC-MS/MS试剂盒产品，批准文号是京药监械（准）字2009第2400778号。

　　对于环孢素的研究，李老师采用了HPLC-MS/MS分析法、TDx分析法和蛋白沉淀板法。HPLC-MS/MS分析法是精密取50µL全血样本，置于1.5mL EP管中，加入50µL红细胞破碎剂，200µL内标CsD，涡旋2min，13200r/min离心5min，取上清液，进样20µL，进行HPLC-MS/MS分析，得出结果需3min，检出限10ng/mL。TDx分析法取全血样本150µL，加入红细胞破碎剂50µL，混匀，再加300µL蛋白沉淀剂混匀，离心5min，取上清液150µL，置TDx仪内测定，得出结果约需15min，检出限100ng/mL。蛋白板沉淀法是将HPLC-MS/MS分析法上清液通过蛋白沉淀板处理，抽滤后再加入600µL乙腈冲洗药物。取上清液，进样20µL，进行HPLC-MS/MS分析，得出结论需3min，检出限10ng/mL。然后，对TDx和HPLC-MS/MS进行相关性分析，并比较HPLC-MS/MS法和TDx分析法测定全血中环孢素A批次-浓度曲线图，以及比较MAS沉淀板与蛋白沉淀质谱法测定全血中环孢素A曲线图。李老师得出结论，HPLC-MS/MS分析方法测定浓度值/TDx法测定浓度值平均值为（54.8±7.35）%，中国人群比值首次被我们提出并用于TDx法推测HPLC-MS/MS法治疗窗。MAS沉淀板法使细胞中的药物释放出来，并且样品处理更干净，浓度升高，跟TDx检测浓度具有很好的相关性，具有较高相关系数和统计学意义。

　　接下来，李老师简要介绍了免疫抑制剂及其合并用药，并讲了一些中毒检测、内源性小分子检测等拓展工作。中毒筛查发生情况统计显示3、5~7、11~12月为高发期，且以女性为主，比例约是男性的2倍。检出药物累计总数277个，计91种，根据统计，应加强艾司唑仑、地西泮、咖啡因等药品的管理和流通，防止用药过量和自杀性用药。李老师所在实验室08年与国外实验室交流与技术共享，成功建立了定量检测人体内42种氨基酸的标准方法。现初步建立起适用于中国人群的正常血氨基酸水平，可明确地根据直观图表，判断体内的氨基酸平，提供个体的营养、代谢、健康状况，并提供相应的改善意见。

　　实验室情况

　　李老师所在实验室的质谱检测平台，在2006年3月安装了3200 QTRAP型液相色谱仪，并在2009年3月买了第二台质谱仪，同时还配备了氮吹仪、固相萃取仪、高精度天平、高速离心机等，进一步完善了该平台。质谱检测技术平台的功能包括中毒药物快速筛查(全国首家)，体内药物分析测试平台，I期新药试验测试平台和体内生物小分子定量分析（全谱氨基酸、新筛）等。目前，实验室已完成30余项新药I期药代动力学研究的检测项目；开展了LC-MS/MS高通量筛查和评估人体内火箭推进剂中毒水平的研究；开展特色临床检测：全谱氨基酸检测，中毒药物检测，他克莫司检测（国内第二个LC-MS/MS试剂盒）；参与多项对外检测服务；现在正在进行氯吡格雷和雷奈酸锶-雷奈酸的药代动力学研究。实验室科研活动丰富多彩，参加了诸多学术会议，对内部员工进行了专业培训，还成功举办了34期质谱沙龙活动，40余单位150余朋友参加，为质谱一线技术人员提供了活跃的交流平台。

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基于芯片多通道纳喷质谱的液滴萃取表面分析（LESA）

　　华质泰科生物技术（北京）有限公司首席技术官刘春胜博士为大家作了题为《基于芯片多通道纳喷质谱的液滴萃取表面分析（LESA）》的报告，主要介绍了芯片多通道纳喷离子源（TriVersa NanoMate^®），并详细讲解了其三大功能模式之一——LESA™（液滴萃取表面分析），以及它在AB SCIEX 质谱系统上的应用。

华质泰科生物技术(北京)有限公司首席技术官 刘春胜 博士

　　芯片多通道纳喷离子源

　　芯片多通道纳喷离子源（TriVersa NanoMate^®）是Advion公司研制推出的最新的、基于芯片的纳升电喷雾离子化（Chip-based ESI）技术，它是集液相色谱（LC）、质谱（MS）、芯片纳升注射（Chip-based Infusion）、馏分收集（Fraction Collection）和液滴萃取表面分析（LESA）等优势于一身的新颖的液质联用（LC/MS）伴侣产品。不同于传统的单一模式的液质联用分析，TriVersa NanoMate^®更适用于通量分析复杂的生物基质样品，以发掘更加丰富的化学和生物学信息。

芯片多通道纳喷离子源(TriVersa NanoMate^®)

　　芯片多通道纳喷离子源（TriVersa NanoMate^®）的原理是，通过成像技术和数码控制，精确定位样品采样点，用一滴溶剂对样品或组织进行表面微萃取，萃取液经由基于芯片的纳升电喷雾离子化(Chip‐based ESI)，进行串联质谱分析。它有三种功能模式：芯片注射分析，与LC/MS分析同步进行馏分收集，LESA™（液滴萃取表面分析）。TriVersa NanoMate^®的ESI芯片是通过微型化释放质谱能量，这种微流控芯片包含刻蚀于硅晶片上的400个纳升电喷雾喷嘴，芯片的加工方法高度重现，确保了喷嘴的一致性，通过纳升级电喷雾喷嘴产生的电场使喷雾更有效、更稳定。芯片软件是TriVersa NanoMate^®拥有知识产权的ChipSoft™，可以对各种参数（如进样体积、进样流速、温度和喷雾时间等）进行调节和控制，当喷雾失效（如发生喷头堵塞），仪器会自动移向下一个可用的喷嘴，保证样品电喷雾的连贯性，此过程在3秒内完成。

ESI芯片

ChipSoft™软件

　　LESA™（液滴萃取表面分析）

　　TriVersa NanoMate^®现在有一种新的采样模式，能够通过浸渍直接从各种表面萃取样品，经纳升电喷雾离子化后来分析。液体萃取表面分析（LESA）由美国橡树岭国家实验室（ORNL）的Vilmos Kertesz 和Gary J. Van Berkel于2009年发明并申请ZL，该技术随后被授权给美国Advion BioSystems, Inc. (Advion) 公司，由Advion对其进行了技术改进和一体化、自动化设计，于2010年3月份完成了商品化，推向全球市场。LESA™可以更灵敏的分析更多的化合物，而且快速、简单、直接。它广泛应用于小分子和大分子分析，如薄的组织切片，TLC薄层板和其它平板分离介质，纸质干血斑，MALDI样品板进行互补的ESI分析，以及对任何含有可萃取物质的表面进行分析。

　　LESA™是怎样工作的呢？TriVersa NanoMate^®首先从吸管架移取一个移液吸头，然后从溶剂瓶中吸取萃取溶剂，将吸取的溶剂推向样品板，使溶剂液滴与样品表面接触，溶剂自样品表面萃取分析物，将溶剂再次吸回枪头，使吸头紧贴于ESI芯片的背面，自然密封，施加电压和少许辅助气压，使发生电喷雾离子化。

LESA™工作流程示意图

　　LESA™与AB SCIEX质谱系统

　　美国橡树岭国家实验室（ORNL）开发的液体萃取表面分析（LESA）技术，使TriVersa NanoMate^®能够对各种表面进行快速、直接的ESI质谱分析，该技术具有对用户友好、方法开发容易、快速简单、信息丰富和灵敏度高等优点。LESA™与AB SCIEX质谱系统配合使用，大大提高了其质谱性能，使之能够分析更多的化合物，获得更丰富的信息。另外，LESA™还可与安捷伦、赛默飞、布鲁克等厂商的质谱仪器兼容。

LESA™与AB SCIEX质谱系统配合使用

　　相关产品：芯片多通道纳喷离子源(TriVersa NanoMate^®)

食品中过敏原的LC-MS/MS检测新方法

　　AB SCIEX 公司殷晓燕老师向大家作了题为《食品中过敏原的LC-MS/MS检测新方法》的报告，比较了食品中过敏原物质的检测方法，并介绍了AB SCIEX 独家率先发布的多种食品中过敏原同时进行检测的方法包。

AB SCIEX 公司 殷晓燕 老师

　　过敏原又称为致敏原或变应原，是指能够使人发生过敏的抗原，特点是接触过敏原一定时间后，机体致敏，反复接触后可出现过敏性症状，一般会逐渐加重。过敏原来源复杂，分为食物过敏原、接触性过敏原、有毒物质过敏、空气过敏原和注入性过敏原，食物过敏原又分为食物过敏蛋白质（植物性、动物性）、食品添加剂和转基因食品等。全世界8%儿童和2%成人对食物过敏，发达国家近20%的人受食物过敏性疾病的困扰，美国儿童6%、成人3.7%发生食物过敏，我国重庆5%儿童食物过敏，而且呈现上升趋势。

　　过敏原检测方法比较

　　过敏原广泛存在含肤质/谷蛋白的谷类、甲壳类、蛋类、鱼类、花生类、大豆类、牛奶类、坚果类、芹菜类、芥末类、芝麻类等食物中。PCR方法不是过敏原检测的首选方法，食品工业化加工通常采用/添加某些成分，可能是DNA与蛋白质分离，PCR方法可能产生危险的假阴性结果;ELISA利用抗体检测蛋白质，过敏原蛋白质结构在加工过程中会发生变化，导致假阴性结果。三种检测方法特点见下表。

	ELISA	PCR	LC-MS/MS
检测原理	蛋白质	DNA	蛋白质/肽（标志物）
灵敏度	1-10ppm	低	1-10ppm
定量	是	RT-PCR（semi）	确证
假阴性/假阳性	是	重要标志物（DNA）	无
专有程序	是（需要抗体）	是	无
费时	是	是	一般

　　MRM在定量已知蛋白方面优点明显：检测灵敏度比传统的扫描模式高500-1000倍，特别适合低丰度蛋白质的鉴定——定性方面最显著的优点；定量的线性范围宽，>6个数量级，特别适合样品含量有显著差异的样品分析；扫描速度快，结合Schedule MRM软件，一次质谱扫描实验可以完成几百对MRM，因此可以同时检测几百种蛋白质的含量的变化；采用MRM方法定量已经成为小分子领域定量的黄金标准，技术成熟，使用简便，在蛋白质组学的应用现在正处于黄金时期，结合生物样本，容易出高档次文章。MRM之后，一定要进行MS/MS确证，目的是确认我们计算肽段面积所用的MRM峰，确实来自于该肽段，而不是其它肽段，因为一段肽段产生的碎片有几十上百个，二级谱图非常复杂，如果没有完整的MS/MS，极有可能产生假阳性。QTRAP系统是一种杂合了三级串联四极杆和线性离子阱的质谱仪，有独特的蛋白质定量流程MIDAS，有助于优化MRM离子对，消除干扰MRM离子对和去除假阳性MRM。

　　多种过敏原同时检测方法包

　　AB SCIEX 公司独家率先发布，多种食品中过敏原同时进行检测的方法包iMethod™。Cliquid™一站式整体解决方案平台，用于常规食品分析检验。简单的四步流程——选择检测项目、建立样品列表、定制报告、提交样品，可以轻松实现大通量进样分析工作。应用MIDAS™工作流程，殷老师检测了饼干、牛奶、小麦、鸡蛋、意大利面和面包中的过敏原，都获得了良好的线性和优异的重复性。

　　最后，殷老师对报告内容作了总结。AB SCIEX 开发的LC-MS/MS分析方法，可以分析几种主要食品（花生、牛奶、小麦和鸡蛋）中的过敏原，具有快速、稳固、灵敏和专一等特性；灵敏度与现行的ELISA和实时的PCR方法等相当，但是CV无需内标，特别是在低浓度时比ELISA方法更优异；LC-MS/MS方法可以同时检测多种过敏原，而每种ELISA方法只能检测一种过敏原；利用MIDAS™ workflow全扫描QTRAP^®MS/MS图谱，同时进行多肽定性和定量确认，消除了ELISA和PCR方法固有的假阴性和假阳性结果；QTRAP^®线性离子阱（LIT）由于MS/MS高灵敏度性能成为过敏原检测的最佳平台。