食品检验之PCR技术

　　摘要：近年来，微生物及其产生的各类毒素引发的食品污染层出不穷，微生物污染造成的食源性疾病仍是世界食品安全中令人头痛的问题。随着生物学技术和微电子技术的发展，食品微生物快速检验技术有了较大进展。PCR技术用于食品中致病微生物的检测较之传统方法具有快速、 特异、 敏感等特性 ,其优越性无可比拟 ,因而该技术在食品致病菌的检测方面具有很大的应用前景。 
　　现代生物技术是在分子生物学基础上建立的创建新的生物类型或新生物机能的实用技术，是现代生物科学和工程技术相结合的产物。现代生物技术以分子生物学、细胞生物学、微生物学、免疫学、遗传学、生理学、系统生物学等学科为支撑，结合了化学、化工、计算机、微电子等学科，从而形成了一门多学科互相渗透的综合性学科。就其应用领域，可分为农业生物技术、医学生物技术、植物生物技术、动物生物技术、食品生物技术、环境生物技术等。 
　　随着我国食品科学技术的发展以及对外贸易的需要 ,食品的检测与分析工作已经提高到一个极其重要的地位。特别是为了保证食品的标准品质 ,开展食品科学技术研究 ,寻找食品污染的根源 ,人们更需要对食品进行各种有效营养物质和对人体有害、有毒物质的检验和分析。自20世纪70年代起，各种分子生物学技术不断出现 ,主要包括核酸分子杂交技术、 PCR 技术和现代免疫技术等 ,目前这些技术在食品检测和分析等方面已经得到了较好的应用，特别是PCR技术。 
　　PCR技术是 1985 年诞生的一项 DNA 体外扩增技术。聚合酶链式反应简称PCR（英文全称：Polymerase Chain Reaction）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方 
　　其基本原理是：在体外对特定的双链DNA片段（靶DNA）进行高效扩增，故又称基因体外扩增法。在体外合适条件下 ,先将靶 DNA变性成为单链 ,然后加入人工设计与合成的两段寡核苷酸引物 ,在热稳定的 DNA 聚合酶和 4 种dNTPs底物存在的条件下 ,这对引物沿靶 DNA 按5′ →3′ 方向延伸 ,合成新的 DNA 双链。新合成的DNA双链又可作为扩增的模板 ,继续重复以上的DNA 多聚酶链式反应。 
　　单核细胞增生性李斯特氏菌:单核细胞增生性李斯特氏菌(LM)对牛奶等食品均有不同程度的污染 ,是食品中的主要病原菌。传统的检测方法存在周期长、 操作繁琐等不足之处。孙焕东等采用裂解法提取DNA ,应用半套式 PCR 对其进行检测 ,设计合成的引物可特异地将其扩增 ,并对其它菌不产生反应 ,显示了较强的特异性。从敏感性看 ,检测限度可达到 10 个 UFC以下 ,较之常规 PCR 检测有所提高;同时 ,检测只需要 5～6h ,较之传统方法快得多。杨百亮通过对 TaqDNA 聚合酶和引物浓度等条件的标化 ,建立简便实用的快速检测牛奶中单核细胞增多性李氏菌试剂盒 ,具有良好的应用前景。 
　　肉毒梭菌:食品中肉毒梭菌是引起肉类中毒的潜在因素。用常规方法从食品中分离鉴定肉毒梭菌至少需要 4 天 ,不能达到快速检测的目的。王颖群等通过检索肉毒神经毒素的基因序列 ,选择保守区设计简并引物 ,用以同时扩增A、 B、 E和 F型毒素的基因。由于肉毒梭菌中毒标本极少 ,因而用 A、B、 E和 F型肉毒梭菌人工感染 10 种食品以制备模拟标本 ,采用适当方法处理后进行 PCR 检测 ,实现了快速、 敏感、 特异检测的检测结果。但由于肉毒梭菌中毒最终由肉毒神经毒素引起 ,而 PCR 只能检测肉毒梭菌的存在与否 ,因而对食品肉毒梭菌和毒素并存 ,或有菌无毒的情况 , PCR 检测不具确定的诊断结果 ,只具参考价值。 
　　沙门氏菌:沙门氏菌是温、 冷血动物的肠道菌 ,分布范围广泛 ,是食物中毒的常见原因之一。利用PCR技术对沙门氏菌进行检测同样具有传统常规培养法所不具有的快速、 简便、 特异性强等特点。P. Whyte等人分别采用传统方法与 PCR 技术对生禽肉中沙门氏菌进行检测发现 ,采用传统方法检出了 16 %的样品被沙门氏菌污染 ,而运用 PCR 技术则检出了 19 %的污染样品 ,可见 PCR 技术的敏感性更强。而当两者结合使用时 ,这一数字上升到了23 %。几乎所有的沙门氏菌都具有侵入性相关遗传因子(irvA) ,以此遗传因子为目标的沙门氏菌(Prime PCR screening kit )由日本鉴酒造株式会社在市场上销售 ,用它不需要特别的技术 ,就可以高灵敏度地检测出沙门氏菌遗传因子 ,从而检测出沙门氏菌。 
　　弧菌:副溶血弧菌是海洋和盐湖中微生物区系的重要成员。水产品常常自身携带该菌 ,因而给该菌在水产品加工中的预防带来难度。有人对相关食品进行副溶血弧菌增菌后 ,分别用新建的 PCR方法和常规培养法进行平行比对实验 ,以评价 PCR方法与常规生化法的符合程度 ,发现结果完全相符 ,说明 PCR法的准确与可靠性。而 PCR 法在操作、周期长短、 灵敏度、 检测成本等方面显然具有更大的优越性。除上述几种食品致病菌外 ,PCR 技术还可用于顽固性梭状芽孢杆菌、 葡萄球菌肠毒素等的检测,且同样具有较高的特异性、 敏感性。 
　　食品安全检测中的一个十分重要的内容是及时准确地检测出食品中的病原微生物。传统的微生物检测方法虽然有效且特异性高 ,但存在检测成本高、速度慢、 效率低等问题 ,难以满足现代社会快速检测的要求 ,并且由于传统的微生物检测方法基本上都需要对病原菌进行人工培养 ,对一些生长缓慢或是新的病原菌就难以用传统方法进行检测。另外 ,对近些年来出现的转基因食品中转基因成分的安全检测也难以用传统检测方法进行检测。而基因探针技术、 PCR 技术、 免疫学技术等作为现代生物学技术手段应用于食品微生物或食品中转基因成分的检测 ,克服了传统食品安全检测方法的缺点和不足 ,而且还具有灵敏度高、 操作简便、 检测周期短、 检测成本低等优点。DNA 探针杂交与 PCR 联合使用检测食品微生物将是今后食品微生物检测技术的一个重要研究方向 ,若能克服两者存在的易污染产生假阳性结果的缺失 ,相信大规模推广应用指日可待。而生物芯片技术虽然在目前看来还未真正用于食品安全检测 ,但由于它结合了多门学科中的高新技术 ,其优越性将会日趋明显 ,预计也将成为未来食品安全检测中的生力军。